Expression fonctionnelle du canal sodique de fuite NALCN en système recombinant

Functional Expression of the Sodium Leak Channel NALCN in recombinant systems

• Auteur / Autrice : Hathaichanok Impheng
• Direction : Arnaud Monteil
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 09/10/2020
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Génomique Fonctionnelle (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Michel Vignes
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Arnaud Monteil, Michel Vignes, Christian Legros, Natalia Prevarskaya
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Christian Legros, Natalia Prevarskaya

Mots clés

Mots clés contrôlés

Physiopathologie

Canaux sodiques

Canaux ioniques

Mots clés libres

Excitabilité cellulaire

Canaux Ioniques

Nalcn

Expression fonctionnelle

Syndromes Neuro-Développementaux sévères

Cell Excitability

Ion Channels

Nalcn

Functional Expression

Severe Neuro-Developmental disorders

Résumé

L’activité électrique des cellules excitables implique une action coordonnée et finement régulée d’un ensemble de protéines spécialisées telles que des canaux ioniques, des transporteurs, des échangeurs ainsi que des récepteurs pour des hormones et des neurotransmetteurs. Le dysfonctionnement d’un seul composant de cet « Excitosome » induit un état pathologique qui peut-être non seulement sévère mais aussi létal chez l’homme. Le projet de thèse a porté sur l’expression du canal sodique de fuite NALCN. NALCN régule le potentiel de repos et donc l’activité électrique de plusieurs types cellulaires dont les neurones et les cellules endocrines/neuroendocrines. L’étude de modèles animaux a montré que NALCN est impliqué dans des grandes fonctions physiologiques telles que la respiration, le rythme circadien, l’activité locomotrice et la nociception. Des mutations ont récemment été décrites chez des patients souffrants des syndromes neuro-développementaux sévères IHPRF1 (Hypotonia, Infantile, with Psychomotor Retardation and Characteristic Facies 1 ; OMIM #615419) et CLIFAHDD (Congenital contractures of the limbs and face, hypotonia, and developmental delay ; OMIM #616266). Ces pathologies sont caractérisées par un large éventail de symptômes incluant un décès prématuré. Les effets de ces mutations sur le courant NALCN n’avaient pas été caractérisés à cause de l’absence de modèle cellulaire fiable pour fonctionnellement exprimer NALCN. Un tel modèle cellulaire est également nécessaire pour identifier des molécules d’intérêt thérapeutique. Dans ce contexte, la première partie du travail de thèse a permis d’identifier la lignée cellulaire neuronale NG108-15 pour l’expression fonctionnelle de NALCN (Bouasse, Impheng et coll, 2019, Sci Rep). Cette lignée cellulaire exprime de manière endogène deux sous-unités de NALCN nommées UNC-79 et UNC-80. Un courant NALCN a été obtenu après transfection des cellules avec NALCN et une autre sous-unité nommée NLF-1. Le courant NALCN a présenté des caractéristiques biophysiques non décrites à ce jour telles qu’une dépendance au potentiel ainsi qu’une cinétique d’inactivation. Ce travail a aussi permis de montrer que des mutations CLIFAHDD et IHPRF1 sont gain- et perte-de-fonction respectivement. De surcroit, le travail a montré que les mutants CLIFAHDD présentaient une cinétique d’inactivation altérée. Dans une deuxième partie du travail de thèse, la lignée cellulaire d’origine hypophysaire GH3 a été identifiée comme d’intérêt pour étudier le courant NALCN (Impheng et coll, FASEB J, en revision). Cette lignée exprime le canalosome NALCN de manière endogène. Une combinaison d’interférence à l’ARN et de surexpression en utilisant des lentivirus suivie d’enregistrements electrophysiologiques a permis de montrer que NALCN est fonctionnel dans ces cellules en étant un acteur essentiel de l’activité électrique des cellules. Cette étude a montré que, en addition des neurones, NALCN module l’excitabilité de cellules hypophysaires et identifie un nouveau modèle cellulaire d’intérêt pour étudier le courant NALCN dans un contexte hypophysaire. La troisième partie du travail a permis de mettre en place un troisième modèle cellulaire. La transfection transitoire de toutes les composantes du canalosome NALCN dans les cellules HEK-293 a permis l’obtention de grands courants NALCN. Ce système cellulaire a été utilisé pour comparer des propriétés biophysiques de NALCN humain avec celles de son orthologue de T. adhaerens. Pris dans son ensemble, ce travail de thèse a permis d’identifier trois modèles cellulaires pour fonctionnellement exprimer NALCN. Cela a permis de caractériser l’impact de mutations humaines sur la fonction de NALCN ainsi que de mettre à jour de nouvelles propriétés biophysiques de NALCN. Ce travail ouvre donc la voie vers l’identification de molécules qui modulent spécifiquement NALCN avec un potentiel thérapeutique.

Electrical activity of excitable cells involves a coordinated and tightly regulated action of a panel of specialized proteins including ion channels, transporters, exchangers, and receptors for hormones and neurotransmitters. Any alteration in the function of one component of this « Excitosome » induces a pathological state that may be not only severe but also letal in human. The thesis project focused on the functional expression of the sodium leak channel NALCN. NALCN regulates the resting membrane potential and subsequently the electrical activity of several cell types including neurons and endocrine/neuroendocrine cells. The study of animal models revealed that NALCN is involved in major physiological functions such as respiration, circadian rhythm, locomotor activity and nociception. Mutations were recently described in patients with severe neurodevelopmental disorders refered to as IHPRF1 (Hypotonia, Infantile, with Psychomotor Retardation and Characteristic Facies 1 ; OMIM #615419) and CLIFAHDD (Congenital contractures of the limbs and face, hypotonia, and developmental delay ; OMIM #616266). These diseases are characterized by a large panel of symptoms that includes an early death. The effects of these mutations on the NALCN current were not known because of the lack of a suitable cell model to functionally express NALCN. A such cell model was also required in order to identify molecules of therapeutical interest. In this context, the first part of the thesis work led to the identification of the neuronal NG108-15 cell line as suitable to functionally express NALCN (Bouasse, Impheng et al, 2019, Sci Rep). This cell line endogenously express two known subunits of NALCN referred to as UNC-79 and UNC-80. A NALCN current was recorded after transfection of the cells with NALCN and another subunit referred to as NLF-1. The NALCN current exhibited unexpected and undescribed biophysical properties with a voltage-dependence and inactivation kinetics. This work also led to the discovery that CLIFAHDD and IHPRF1 mutations are gain- and loss-of-function repectively. In addition, this study showed that CLIFAHDD mutants exhibited altered inactivation kinetics. In a second part of the thesis, the pituitary GH3 cell line was dentified as relevant for NALCN expression (Impheng et al, FASEB J, in revision). This cell line endogenously expressed the whole NALCN channelosome. A combination of lentiviral mediated-knockdown and overexpression approaches followed by electrophysiological recordings showed that NALCN is functional in GH3 cells and is a crucial player of excitability of this cell types. This study revealed that, in addition to neurons, NALCN regulates pituitary cell excitability and provided a cell model to study NALCN in a pituitary environment. The third part of the work allowed to setup a third cell model. Indeed, transient expression of the whole NALCN channelosome in HEK-293 cells allowed for a robust expression of the NALCN current. This system was used to compare some properties of the human NALCN with the T. adhaerens counterpart. A a whole, this thesis work resulted in the identification of three cellular models to functionally express NALCN. This led to identify the impact of pathogenic variants on NALCN function as well as to reveal novel biophysical properties of the NALCN current. This study paved the way to the identification the discovery of molecules that specifically modulate NALCN with a therapeutic potential.