Cribles CRISPR/Cas9 à l'échelle du génome : identification de l'hélicase à ARN DDX42 comme nouvel inhibiteur viral

A genome-wide CRISPR/Cas9 knock-out screen identifies the DEAD box RNA helicase DDX42 as a broad viral inhibitor

• Auteur / Autrice : Boris Bonaventure
• Direction : Caroline Goujon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 14/12/2020
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Recherche en Infectiologie de Montpellier (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Nathalie Arhel
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Caroline Goujon, Nathalie Arhel, Stéphane Emiliani, Florence Margottin-Goguet, Jean-Christophe Paillart, Stuart Neil
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Stéphane Emiliani, Florence Margottin-Goguet

Mots clés

Mots clés contrôlés

CRISPR-Cas9

Résistance aux maladies

Infections à VIH

Mots clés libres

Vih-1

Immunité innée

Crible CRISPR/Cas9

Hiv-1

Innate immunity

CRISPR/Cas9 screen

Résumé

L’utilisation de cribles à l’échelle du génome basé sur la technologie CRISPR/Cas9 est une approche puissante, permettant l’identification de nouveaux facteurs impliqués dans des phénotypes d’intérêt. Afin d’identifier de nouveaux inhibiteurs du VIH-1, nous avons développé un crible CRISPR/cas9 à l’échelle du génome en utilisant l’IFN de type I pour créer un environnement cellulaire hostile à la réplication virale. Ce crible nous a permis d’identifier DDX42, membre de la famille des hélicases à motif DEAD, comme inhibiteur intrinsèque du VIH-1. Les cellules invalidées pour DDX42 deviennent plus susceptibles à l’infection par le VIH-1, indépendamment du système IFN. Cette activité antivirale de la protéine DDX42 endogène a été observée en lignées modèles, mais aussi en lymphocytes T CD4 primaires et en macrophages dérivés de monocytes, cellules cibles du VIH-1. Par ailleurs, l’expression ectopique de DDX42 inhibe efficacement l’infection par le VIH-1. L’effet positif de la déplétion de DDX42 sur l’infection du VIH-1 est directement corrélé à une augmentation de l’accumulation d’ADN viral, suggérant que DDX42 affecte la transcription inverse ou la stabilité du génome. De façon intéressante, des essais de ligation de proximité ont montré que DDX42 était dans l’environnement proche de la Capside du VIH-1 en macrophages primaires infectés. L’activité antivirale de DDX42 affecte également d’autres lentivirus que le VIH-1, ainsi que le rétrovirus MLV et les rétrotransposons de type LINE-1. Enfin, nous démontrons que DDX42 est capable d’inhiber l’infection par d’autres virus tels que les alphavirus, les flavivirus et les coronavirus.

Genome-wide CRISPR/Cas9 knock-out genetic screens are powerful approaches to unravel new regulators of various cellular processes, including viral replication cycles. With the aim of identifying new cellular inhibitors of HIV-1, we have developed a whole-genome CRISPR/Cas9 knock-out screen using the ability of type I interferon to potently inhibit HIV-1 infection in order to create a cellular environment hostile to HIV-1 replication. This screen led to the identification of the DEAD-box RNA helicase, DDX42, as an intrinsic inhibitor of HIV-1. Cells depleted for DDX42 became more susceptible to HIV-1 infection both in the presence and in the absence of interferon. The ability of endogenous DDX42 to potently inhibit HIV-1 infection was observed in cell lines and in physiological targets of HIV-1, primary CD4+ T cells and monocyte-derived macrophages. Similarly, DDX42 overexpression potently inhibited HIV-1 infection. The positive impact of DDX42 depletion on HIV-1 infection was directly correlated to a substantial increase in viral DNA accumulation, pinpointing an inhibitory role of DDX42 on reverse transcription. Within cells, DDX42 was found primarily in the nucleus but was also present in the cytoplasm. Interestingly, proximity ligation assays showed that DDX42 was in the close vicinity of HIV-1 Capsid during infection of primary monocyte-derived macrophages. Investigation on DDX42 specificity showed that different lentiviruses, the retrovirus MLV and the retrotransposition of LINE-1 were inhibited by DDX42. Finally, we reveal that DDX42 was able to decrease infection with a variety of viruses including alphaviruses, flaviviruses and coronaviruses.