Rôle de la kinase Mps1 dans la segregation chromosomique chez S. cerevisiae

Role of the protein kinase MPS1 in the regulation of chromosome segregation in budding yeast mitosis

• Auteur / Autrice : Giorgia Benzi
• Direction : Simonetta Piatti
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 19/10/2020
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche de Biochimie Macromoléculaire (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Thierry Lorca
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Simonetta Piatti, Thierry Lorca, Katja Wassmann, Daniele Fachinetti
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Katja Wassmann, Daniele Fachinetti

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microorganismes -- Biotechnologie

Chromosomes

Protéines kinases

Mots clés libres

Kinase

S. cerevisiae

Segregation chromosomique

Sac

Kinase

Budding yeast

Chromosome segregation

Sac

Résumé

Mps1 est une protéine kinase conservée qui, pendant la mitose, corrige les attachements inappropriés entre kinétochores et microtubules, assurant ainsi la bi-orientation des chromosomes. Cependant, ses cibles critiques dans ce processus restent largement inconnues. Mps1 contrôle également le « spindle assembly checkpoint » (SAC), qui arrête la ségrégation des chromosomes en métaphase jusqu'à ce que la bi-orientation soit atteinte. Son rôle dans l'activation du SAC est antagonisé par la phosphatase PP1 et implique la phosphorylation de la protéine d’échafaudage au kinétochore KNL1/Spc105, qui à son tour recrute la kinase Bub1 pour favoriser l'assemblage des complexes effecteurs du SAC. Une question cruciale est si la correction des erreurs et l'activation du SAC font partie d'une seule et même voie ou des voies séparables.Au cours de ma thèse, j'ai caractérisé un nouveau mutant thermosensible, mps1-3, qui est défectueux dans la bi-orientation des chromosomes et la signalisation du SAC. La mutation mps1-3 change une sérine conservée dans le domaine kinase en phénylalanine et, de façon surprenante, la protéine Mps1-3 a une activité catalytique accrue par rapport à la protéine sauvage. Inversement, la protéine ne se localise pas aux kinétochores, ce qui suggère que les défauts mitotiques du mutant mps1-3 proviennent du manque de phosphorylation des cibles critiques aux kinétochores.Grâce à un crible génétique, j'ai identifié des mutations qui supprimaient la thermosensibilité du mutant mps1-3 en affectant l'interaction entre la protéine du kinétochore Spc105/KNL1 et la phosphatase PP1, et j’ai démontré que des niveaux réduits de PP1 aux kinétochores sous-tendent la suppression. Remarquablement, les suppresseurs restauraient à la fois la signalisation du SAC et la bi-orientation des chromosomes, ce qui suggère que Mps1 contrôle les deux processus par le même mécanisme moléculaire. Nous avons proposé que la phosphorylation de Spc105/KNL1, qui conduit au recrutement de Bub1 aux kinétochores et est antagonisée par la phosphatase PP1, est une fonction cruciale de Mps1 dans la correction des liaisons inappropriées kinétochores-microtubules comme pour l'activation du SAC. De façon cohérente, la phosphorylation de Spc105 et la localisation de Bub1au kinétochore étaient affectées dans les cellules mps1-3 et restaurées dans les suppresseurs susmentionnés. De plus, le recrutement artificiel de Bub1 à Spc105 supprimait les défauts de ségrégation des cellules mutantes mps1-3. Ainsi, une conclusion principale de mon travail de thèse est que le SAC et la correction d'erreurs sont déclenchés par un seul dispositif sensoriel impliquant Mps1 et antagonisé par PP1.Grâce au même crible génétique ci-dessus, j'ai également trouvé des suppresseurs portant des mutations dans la protéine F-box Grr1, qui fait partie du complexe ubiquitine-ligase SCF. Mes données préliminaires indiquent que Grr1 se localise aux kinétochores, suggérant que le complexe SCFGrr1 pourrait être un nouvel acteur dans le contrôle de la bi-orientation des chromosomes. Enfin, j'ai pu isoler des suppresseurs intragéniques, qui portent une seconde mutation dans MPS1 et restaurent les fonctions mitotiques de la protéine Mps1-3. Les données recueillies jusqu'à présent indiquent que cette classe de mutations, contrairement aux suppresseurs extragéniques ci-dessus, rétablit la localisation de Mps1 au kinétochore. Étant donné que Mps1 régule son propre turnover aux kinétochores par autophosphorylation, nous avions émis l’hypothèse que les suppresseurs puissent rétablir la localisation de Mps1-3 au kinétochore en diminuant son activité catalytique. Étonnamment, bien que la plupart des mutations suppressives réduisaient la capacité de Mps1-3 à phosphoryler une cible exogène, elles n'affectaient pas de façon significative l'autophosphorylation, ce qui suggère que la phosphorylation dépendante de Mps1 d'une protéine non identifiée au kinétochore pourrait influencer le turnover de Mps1.

Mps1 is a conserved protein kinase that during mitosis corrects improper kinetochore–microtubule attachments, thereby ensuring chromosome biorientation and balanced chromosome segregation. Yet, its critical phosphorylation targets in this process remain largely elusive. Mps1 also controls the spindle assembly checkpoint (SAC), which halts chromosome segregation in metaphase until biorientation is attained. Its role in SAC activation is antagonised by the PP1 phosphatase and involves phosphorylation of the kinetochore scaffold Knl1/Spc105, which in turn recruits the Bub1 kinase to promote assembly of SAC effector complexes. A crucial question is whether error correction and SAC activation are part of a single or separable pathways.During my PhD thesis, I characterized a novel temperature sensitive mutant, mps1-3, that is defective in chromosome biorientation and SAC signaling. The mps1-3 mutation changes a conserved serine in the kinase domain to phenylalanine, and, surprisingly, the Mps1-3 protein has enhanced catalytic activity compared to the wild type protein. Conversely, the protein does not localize at kinetochores, suggesting that the mps1-3 mitotic defects stem from the lack of phosphorylation of critical kinetochore substrates.Through an unbiased screen for spontaneous suppressors of the temperature-sensitivity of the mps1-3 mutant, I found suppressing mutations that affected the interaction between the kinetochore protein Spc105/KNL1 and the phosphatase PP1, suggesting that reduced levels of PP1 at kinetochores underlie the suppression of the temperature-sensitivity of mps1-3 cells. Importantly, the suppressors restored both SAC signaling and proper chromosome bi-orientation, suggesting that the same molecular mechanism underlies the role of Mps1 in both processes. We have proposed that phosphorylation of Spc105/KNL1, which leads to Bub1 kinetochore recruitment and is antagonized by the phosphatase PP1, is a crucial function of Mps1 in the correction of improper kinetochore-microtubule attachments as it is for SAC activation. Consistently, Spc105 phosphorylation and Bub1 kinetochore localization were affected in mps1-3 cells and restored in the aforementioned suppressors. Moreover, artificial recruitment of Bub1 to Spc105 suppressed the chromosome segregation defects of mps1-3 mutant cells.Thus, a main conclusion of my thesis work is that SAC and error correction are triggered by a single sensory device involving Mps1 and antagonized by PP1.Through the same genetic screen, I also found suppressors carrying mutations in the F-box protein Grr1 that is part of the SCF ubiquitin-ligase complex. My preliminary data indicate that Grr1 might localize at kinetochores, suggesting that the SCFGrr1 complex could be a novel player in the control of chromosome bi-orientation at kinetochores. Finally, I could isolate intragenic suppressors, carrying a second mutation in MPS1 that restored the mitotic functions of the Mps1-3 protein. The data gathered so far indicate that this class of suppressing mutations, unlike the extragenic suppressors above, re-establish Mps1 kinetochore localization. Since Mps1 regulates its own turnover at kinetochores by autophosphorylation, we postulated that the elevated kinase activity of the Mps1-3 mutant protein might be responsible for its displacement from kinetochores and the suppressors might re-establish kinetochore localization of Mps1-3 by decreasing its kinase activity. Surprisingly, although most of the suppressing mutations reduced the ability of Mps1-3 to phosphorylate an exogenous substrate, they did not significantly affect autophosphorylation, suggesting that Mps1-dependent phosphorylation of an unidentified kinetochore protein could influence Mps1 residence time.