Role of I-BAR proteins and membrane curvature in HIV-1 assembly and release

par Kaushik Inamdar

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Delphine Muriaux et de Cyril Favard.

Le président du jury était Anne Blangy.

Le jury était composé de Delphine Muriaux, Cyril Favard, Anne Blangy, Andrea Cimarelli, Olivier Destaing, Didier Marguet.

Les rapporteurs étaient Andrea Cimarelli, Olivier Destaing.

  • Titre traduit

    Rôle des protéines I-BAR et de la courbure membranaire dans l’assemblage du virus HIV-1


  • Résumé

    Lors de l'assemblage et du bourgeonnement du VIH, la membrane plasmique subit une courbure entraînée par l'auto-assemblage du VIH-1 Gag au site d'assemblage vers l'extérieur de la cellule. Cependant, la multimérisation de Gag peut ne pas être suffisante et Gag peut avoir besoin de recruter des facteurs cellulaires pour induire une courbure de membrane locale. Nous avons récemment rapporté que la libération de particules de VIH-1 Gag dépendait de l'activation de la voie de signalisation Rac1 / IRSp53 / Wave2 / Arp3 dans les cellules Jurkat T et les lymphocytes sanguins primaires. Ce complexe cellulaire, lorsqu'il est activé, est recruté dans la membrane plasmique cellulaire et favorise le recrutement de la ramification de l'actine, la polymérisation de l'actine et le remodelage de la membrane dans les lamellipodes. En particulier, la protéine IRSp53 contient un domaine I-BAR capable d'induire une courbure membranaire via la reconnaissance du phospholipide de membrane plasmique PI (4,5) P2. Ce phospholipide est également spécifiquement reconnu par le domaine Matrix N-terminal de Gag et est un cofacteur lipidique du ciblage de Gag vers la membrane plasmique et de l'assemblage du VIH-1. Ce projet de recherche visait à caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires de l'implication de l'IRSp53 dans l'assemblage du VIH-1 dans les cellules T CD4 et HEK293T. Nos résultats montrent que l'IRSp53 est associé à des particules virales et que son renversement par l'ARNsi diminue la libération du VIH-1 dans les lymphocytes T et les cellules T HEK293. La microscopie électronique des cellules renversées pour IRSp53 a révélé un phénotype frappant de bourgeons viraux arrêtés à un stade précoce de l'assemblage. L'immunoprécipitation de l'IRSp53 a montré une conversion indépendante de p6 de HIV-1 Gag, indiquant une complexation intracellulaire de Gag et de l'IRSp53. Le fractionnement cellulaire et la flottation de la membrane ont montré que le recrutement de l'IRSp53 vers la membrane cellulaire double lors de l'expression du VIH-1 Gag. La microscopie PALM / STORM à molécule unique bicolore et les analyses ultérieures ont montré l'IRSp53 à proximité des amas Gag. Nous avons également trouvé une incorporation spécifique de l'IRSp53 dans les particules de VIH-1 Gag par rapport à d'autres protéines I-BAR, un phénomène dépendant de son domaine I-BAR. Comme le domaine I-BAR est impliqué dans la courbure de la membrane, nous avons ensuite sondé cet aspect de l'implication de l'IRSp53 dans l'assemblage du VIH-1. L'analyse des images de microscopie électronique a révélé un défaut de courbure pour les bourgeons des cellules assommées IRSp53. Des études concomitantes dans des systèmes GUV in vitro sans cellule ont également indiqué un rôle pour la courbure de la membrane induite par IRSp53 dans la liaison à la membrane Gag. Ces résultats confirment le rôle essentiel de l'IRSp53 dans les premiers stades de l'assemblage du VIH-1. Enfin, comme l'IRSp53 est un acteur essentiel dans l'échafaudage des protéines de signalisation de l'actine, nous avons établi un rôle pour le Rac1 activé dans le recrutement de la membrane IRSp53 en aval du VIH-1 Gag, et testé l'implication du RacGEF Tiam1 dans la production de particules du VIH-1. La microscopie à super résolution révèle également la présence de nanostructures d'actine sur les sites d'assemblage du VIH-1. Tous ces résultats mettent en évidence le rôle nouveau et essentiel de la protéine I-BAR à courbure membranaire IRSp53, et la mobilisation de l'actine corticale, dans les phases tardives de la réplication du VIH-1.


  • Résumé

    During the HIV assembly and budding, the plasma membrane undergoes a curvature driven by HIV-1 Gag self-assembly at the assembly site towards the exterior of the cell. However, the multimerization of Gag may not be sufficient and Gag may need to recruit cell factors for inducing local membrane curvature. We recently reported that the HIV-1 Gag particle release was dependent on the activation of the signalling pathway Rac1/IRSp53/Wave2/Arp3 in Jurkat T cells and primary blood lymphocytes. This cellular complex, when activated, is recruited to the cell plasma membrane and promotes the recruitment of actin branching, actin polymerisation and membrane remodelling in lamellipodia. In particular, the protein IRSp53 contains an I-BAR domain capable of inducing membrane curvature via the recognition of the plasma membrane phospholipide PI(4,5)P2. This phospholipid is also specifically recognized by the N-terminal Matrix domain of Gag and is a lipidic cofactor of Gag targeting to the plasma membrane and of HIV-1 assembly. This research project aimed at characterizing the cellular and molecular mechanisms of IRSp53 involvement in HIV-1 Gag assembly in CD4 T cells and HEK293T cells. Our results show that IRSp53 is associated with viral particles and that its knockdown by siRNA decreases HIV-1 release in T lymphocytes and HEK293 T cells. Electron microscopy of cells knocked down for IRSp53 revealed a striking phenotype of viral buds arrested at an early stage of assembly. Immunoprecipitation of IRSp53 showed a p6 independent pulldown of HIV-1 Gag, indicating intracellular complexing of Gag and IRSp53. Cellular fractionation and membrane flotation showed that IRSp53 recruitment to cellular membrane doubles upon expression of HIV-1 Gag. Dual colour single molecule PALM/STORM microscopy and subsequent analyses showed IRSp53 in close proximity to Gag clusters. We also found specific incorporation of IRSp53 in HIV-1 Gag particles as compare to other I-BAR proteins, a phenomenon dependent on its IBAR domain. As the I-BAR domain is involved in membrane curvature, we then probed this aspect of IRSp53 involvement in HIV-1 assembly. Analysis of electron microscopy images revealed a curvature defect for buds from IRSp53 knocked out cells. Concomitant studies in cell free in vitro GUV systems also indicated a role for IRSp53 induced membrane curvature in Gag membrane binding. These results affirm the essential role of IRSp53 in the early stages of HIV-1 assembly. Finally as IRSp53 is a vital player in scaffolding actin signaling proteins, we established a role for activated Rac1 in IRSp53 membrane recruitment downstream of HIV-1 Gag, and test the involvement of the RacGEF Tiam1 in HIV-1 particle production. Super resolution microscopy also reveals the presence of actin nanostructures at HIV-1 assembly sites. All these results highlight the novel and essential role of the membrane curving I-BAR protein IRSp53, and the mobilization of cortical actin, in the late phases of HIV-1 replication.



Le texte intégral de cette thèse sera accessible librement à partir du 31-12-2021

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