Analyse fonctionnelle des nucléoporines dans le maintien de la ploïdie chez les trypanosomatidés

Unravelling the role of nucleoporins in the ploidy maintenance of trypanosomatid parasites

• Auteur / Autrice : Akila Yagoubat
• Direction : Yvon Christian Frédéric Sterkers, Artur Scherf
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 11/09/2020
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Maladies infectieuses et vecteurs : écologie, génétique, évolution et contrôle (Montpellier)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Yvon Christian Frédéric Sterkers, Artur Scherf, Lucy Glover, Mélanie Bonhivers, Luisa Figueiredo, Kai Wengelnik
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Lucy Glover, Mélanie Bonhivers

Mots clés

Mots clés contrôlés

Pores nucléaires

Trypanosoma

Leishmania

Mots clés libres

Leishmania

CRISPR-Cas9

Trypanosoma

Nucleoporine

Segregation

Replication

Résumé

Trypanosoma brucei et Leishmania sp sont des parasites eucaryotes divergents appartenant à l’ordre des kinetoplastidae. Outre l’intérêt scientifique, la compréhension de leur biologie présente un intérêt médical et économique. Ces parasites proches d’un point de vue phylogénétique présentent des caractéristiques moléculaires et cellulaires originales communes qui restent mal connues, telles que l'organisation génomique en grandes unités transcriptionnelles polycistroniques, l'absence de régulation transcriptionnelle et les modifications post-transcriptionnelles de l'ARNm. Parmi les caractéristiques spécifiques de ces parasites, nous nous sommes intéressés au comportement des pores nucléaires et à leur importance, en particulier pendant la mitose. Les trypanosomatidés présentent une mitose dite fermée durant laquelle l'enveloppe nucléaire reste intacte. Les complexes de pores nucléaires (CPN) sont de grands canaux multiprotéiques intégrés dans l'enveloppe nucléaire et constitués de nucléoporines (NUP). La fonction principale des CPN est de réguler le transport nucléo-cytoplasmique. Cependant, les NUP apparaissent également comme d'importants acteurs dans d'autres processus fondamentaux, notamment dans la ségrégation chromosomique, la transcription et la cytokinèse. En utilisant la technique du CRISPR-Cas9, nous avons marqué la nucléoporine MLP1 et montré qu’elle était située dans le panier nucléaire des CPN chez T. brucei et L. mexicana. Le knockdown par ARN interférence de MLP1 chez les formes procycliques de T. brucei entraîne un défaut de croissance, une désorganisation nucléaire et une grave instabilité génomique. L'analyse par FISH et par cytométrie en flux a montré une forte réduction des cellules disomiques qui a été compensée par une augmentation des cellules monosomiques et trisomiques. Ainsi, le knockdown de TbMLP1 est associé à une aneuploïdie mosaïque mal tolérée chez T. brucei. La voie ARNi étant absente chez Leishmania, nous avons dû mettre au point et utiliser un système CRISPR-Cas9 inductible pour étudier LmxM_MLP1. Le knockout inductible de MLP1 a entrainé une forte réduction de la croissance, une réduction importante du pourcentage de cellules diploïdes et un défaut dans la progression du cycle cellulaire associé à une perturbation générale de l'architecture nucléaire. Le marquage de protéines du kinétochore et du fuseau mitotique a montré l’importance de MLP1 dans le processus de ségrégation des chromosomes. La colocalisation avec d'autres nucléoporines a permis d’observer l’architecture de l'enveloppe nucléaireAinsi, nos résultats indiquent que MLP1 est une protéine essentielle, impliquée dans le maintien de l’intégrité de la ploïdie et de l'organisation nucléaire chez T. brucei et L. mexicana. De plus, le séquençage des brins naissants a montré son implication potentielle, à confirmer, dans la réplication de l'ADN.

Trypanosoma brucei and Leishmania are divergent eukaryotes belonging to the kinetoplastidae. Understanding their biology, besides its scientific interest, has medical and economical relevance. These 'sister' parasites exhibit common original molecular and cellular features which remain poorly known such as the genomic organization into large polycistronic transcriptional units, the absence of transcriptional regulation and the messenger RNA (mRNA) processing. Among the specific features of these parasites we got interested into the nuclear pore behaviors and importance particularly during mitosis. Trypanosomatids display a closed mitosis where the nuclear envelop remains intact. Nuclear pore complexes (NPCs) are large multiprotein channels embedded in the nuclear envelope (NE) and made of nucleoporins (NUPs). The primary function of NPCs is to regulate nucleo-cytoplasmic transport; however, NUPs are also emerging as important actors in other core processes including chromosomal segregation, transcription, and cytokinesis. Here, using CRISPR-Cas9, we showed that the GFP-tagged nucleoporin MLP1 is located in the nuclear basket of the NPCs in T. brucei and Leishmania. TbMLP1 RNA interference knockdown in T. brucei PCFs led to a growth defect, nuclear disorganization and severe genomic instability. FISH and flow cytometry analysis demonstrated a large reduction in disomic cells, which was compensated by an increase in monosomic and trisomic cells, unsurprisingly undetectable by bulk WGS. Thus, TbMLP1 knockdown is associated with an un-tolerated mosaic aneuploidy in T. brucei. The RNA interference (RNAi) pathway being absent in Leishmania, we successfully developed an inducible CRISPR-Cas9 system to study essential genes in L. mexicana, among which LmxM_MLP1. The inducible knockout (iKO) of MLP1 led to a severe growth defect, a reduction in diploid cells and a defect in cell cycle progression associated with a general disturbance of the nuclear architecture. Taken together, our results indicate that MLP1 is required for the maintenance of genome and nuclear organization in T. brucei and L. mexicana. With a potential implication in: DNA replication showed using Small Nascent Strand sequencing (SNS-seq), nuclear envelop morphology using colocalization analysis of other nucleoporins and in segregation process using mitotic spindle and kinetoplastid kinetochore (KKT) proteins distribution. Our data already provide novel insights into the molecular mechanisms regulating genome stability and its interesting connection to the NPCs in the Trypanosomatids.