Application des approches de transcriptomique, de métabolomique et de criblage haut-débit pour démêler les mécanismes impliqués dans l'embryogenèse somatique chez Coffea arabica

Applying transcriptomic, metabolomic and high-throughput screening approaches to unravel the underlying mechanisms of somatic embryogenesis in Coffea arabica

• Auteur / Autrice : Rayan Awada
• Direction : Hervé Etienne, Benoît Georges Bertrand
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie du développement
• Date : Soutenance le 11/06/2020
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale GAIA Biodiversité, agriculture, alimentation, environnement, terre, eau (Montpellier ; 2015-...)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Interactions plantes microorganismes environnement (Montpellier ; 2011-2020)
• Jury : Président / Présidente : Pierre Czernic
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Hervé Etienne, Benoît Georges Bertrand, Pierre Czernic, Philippe Label, Pierre Coutos-Thévenot, Soazig Guyomarc'h, Laurent Legendre
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Philippe Label, Pierre Coutos-Thévenot

Mots clés

Mots clés contrôlés

Coffea arabica

Métabolomique

Embryogenèse somatique

Mots clés libres

Criblage haut-Débit

Destin cellulaire

Embryogenèse somatique

Métabolomique

Totipotence

Transcriptomique

Cell fate

High-Throughput screening

Metabolomics

Somatic embryogenesis

Totipotency

Transcriptomics

Résumé

L'embryogenèse somatique (ES) est l'un des processus de propagation les plus prometteurs pour la diffusion à grande échelle de variétés élites. Cependant, quelle que soit l'espèce considérée, les recherches sur l’ES restent essentiellement empiriques et à bas débit, entraînant une difficulté à répondre à la demande croissante en matériel végétal, notamment en raison des faibles progrès techniques au cours des dernières décennies. Cette thèse présente un travail pionnier où deux groupes leader - Nestlé et le Cirad - ont décidé d'unir leurs forces pour démêler les mécanismes moléculaires impliqués dans les étapes clés de l’ES du caféier Arabica, l’un des procédés les plus avancés, en y appliquant les dernières technologies de métabolomique et de transcriptomique. En parallèle, la mise au point d’un système de criblage à haut débit de composés actifs sur l’ES, qui permettrait d'accélérer l'optimisation des protocoles, n'a toujours pas été proposée pour la micropropagation végétale.Résultats Soixante-dix échantillons (14 stades de développement x 5 répétitions biologiques) couvrant l'ensemble du processus d’ES ont été étudiés. Une approche statistique robuste appliquée aux données RNA-seq a permis d'identifier 6 transitions (‘switches’) de développement clés pour le succès biologique de l’ES c.à.d. la production en masse d’embryons somatiques, et a révélé l’influence directe des facteurs (‘drivers’) environnementaux. La métabolomique a mis en évidence d'énormes reconfigurations des contenus hormonaux, des voies métaboliques primaires et des composés phénoliques lors des évènements précoces de la dédifférenciation et de la redifférenciation. La totipotence atteint son expression la plus visible au stade embryogène lorsque sont totalement inhibées les voies biochimiques liées au métabolisme du sucre et, au contraire, lorsque est activée l’expression des gènes codant pour des facteurs de transcription. L'étude a également montré que les profils de transcrits et de métabolites représentent des signatures discriminantes du destin cellulaire. Une liste de 23 gènes et 17 métabolites marqueurs du succès des différentes phases de développement a été identifiée, y compris le stade cals embryogènes si stratégique car à l’interface Dédifférenciation-Redifferentiation. En parallèle, nous avons réussi à reproduire à l'échelle pilote la différenciation d’embryons somatiques à partir de suspensions dans un système miniaturisé compatible avec une plateforme automatisée et ainsi permis le criblage de 4 régulateurs épigénétiques (HDACi) à différentes concentrations, apportant ainsi une preuve de concept de la faisabilité d’une optimisation haut-débit des milieux nutritifs. Pour toutes les étapes de développement clés de l’ES, le décryptage des principaux mécanismes moléculaires ainsi que l’identification de marqueurs moléculaires spécifiques offre de nouvelles perspectives pour la compréhension fine de ce phénomène de régénération et son optimisation raisonnée. Des stratégies sont proposées pour la validation des marqueurs candidats et l’industrialisation du système de criblage haut-débit. Il est proposé une combinaison des deux approches –omiques et automatisation pour une optimisation des protocoles rationnelle et plus efficace, permettant aux procédés d’ES de soutenir la diffusion à très grande échelle du progrès génétique chez le caféier.

Somatic embryogenesis (SE) is one of the most promising propagation processes for the large-scale dissemination of elite varieties. However, whatever the species considered, research on SE remains essentially empirical and low-throughput, making it difficult to meet the growing demand for plant material, in particular due to the slow technical progress in recent decades. This thesis presents a pioneering work in which two leading groups - Nestlé and CIRAD - have decided to join forces to unravel the molecular mechanisms involved in the key stages of SE in Arabica coffee, one of the most advanced processes, by applying the latest metabolomics and transcriptomics technologies. In parallel, the implementation of a high-throughput screening system for active compounds on SE, that would speed up the optimization of protocols, has not yet been proposed for plant micropropagation.ResultsSeventy samples (14 developmental stages x 5 biological replicates) covering the whole SE process were studied. A robust statistical approach applied to RNA-seq data led to the identification of 6 key developmental switches for the biological success of SE i.e. the mass production of somatic embryos, and revealed the direct influence of environmental drivers. Metabolomics highlighted huge reconfigurations of hormonal contents, primary metabolic pathways and phenolic compounds during the early events of dedifferentiation and redifferentiation. Totipotency reaches its most visible expression at the embryogenic stage when the biochemical pathways related to sugar metabolism are inhibited and, on the contrary, when the expression of genes coding for transcription factors is activated. The study also showed that transcript and metabolite profiles represent discriminant signatures of cell fate. A list of 23 genes and 17 metabolites that mark the success of the different developmental phases has been identified, including the embryogenic callus stage, so strategic due to its position at the Dedifferentiation-Redifferentiation interface. In parallel, we succeeded in reproducing on a pilot scale the differentiation of somatic embryos from liquid cell suspensions in a miniaturized system compatible with an automated platform and thus allowed the screening of 4 epigenetic regulators (HDACi) at different concentrations, bringing a proof of concept of the feasibility of nutrient media high-throughput optimization. For all SE key developmental stages, deciphering the main molecular mechanisms as well as the identification of specific molecular markers offers new perspectives for a detailed understanding of this regeneration phenomenon and its rational optimization. Strategies are proposed for the validation of candidate markers and the industrialization of the high-throughput screening system. A combination of both -omics and automation approaches is proposed for rational and more efficient protocol optimization, allowing the SE processes to support the very large-scale dissemination of genetic progress in coffee.