Le facteur de transcription antioxydant NRF2 comme nouveau régulateur de la matrice extracellulaire des fibroblastes de peau humaine

The antioxidant transcription factor NRF2 as a new regulator of the extracellular matrix in human skin fibroblasts

• Auteur / Autrice : Mélanie Salamito
• Direction : Florence Ruggiero
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 13/11/2020
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : École normale supérieure de Lyon (2010-...)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon (Lyon ; 2007-....)
• Jury : Président / Présidente : Chloé Feral
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Florence Ruggiero, Chloé Feral, Collin Ewald, Alexander Nyström, Laurent Duca, Sybille Jäger
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Collin Ewald, Alexander Nyström

Mots clés

Mots clés contrôlés

Collagène

Matrice extracellulaire

Mots clés libres

Fibroblastes primaires cutanés humains

Matrice extracellulaire

Collagènes

NRF2

Fibrillogénèse

RNA-seq

Techniques d’ARN interférence

Human dermal fibroblasts

Extracellular matrix

Collagens

NRF2

Fibrillogenesis

RNA-seq

RNA silencing strategies

Résumé

Le facteur de transcription nuclear factor erythroid-2-related factor (NRF2) est connu dans différentes espèces pour son rôle dans la défense cellulaire contre les stress oxydatifs et xénobiotiques. SKN-1, l'homologue de NRF2 chez C.elegans, est un important régulateur de la longévité du nématode qui, dans certaines conditions métaboliques spécifiques, agit de manière surprenante par l'activation de l'expression des collagènes en plus des gènes de détoxification. Les fibroblastes sont les principaux producteurs et organisateurs de tissus riches en collagène et, à ce titre, jouent un rôle clé dans l'homéostasie du derme. Nous avons étudié le nouveau rôle potentiel de NRF2 dans la régulation de l'expression de la matrice extracellulaire (MEC) dans les fibroblastes cutanés humains. La dérégulation de NRF2 a été réalisée en utilisant siRNA et shRNA. Une analyse transcriptomique globale des fibroblastes cutanés humains siNrf2, effectuée par RNA-seq, a révélé qu’en plus des cibles NRF2 connues, les gènes du matrisome et du tissu-squelette étaient les catégories de gènes les plus affectées, comprenant certains gènes clés de la MEC. L'analyse de la production et de l'organisation de la MEC a ensuite été réalisée en utilisant une combinaison de microscopies (SHG, confocal, TEM et AFM) dans des fibroblastes shNrf2 en culture. La sous-expression à long terme de NRF2 dans les fibroblastes (shNRF2) affecte les niveaux d’expression du collagène I, ainsi que la formation des fibrilles de collagènes, probablement dû au ratio collagène I/collagène V perturbé. L’analyse transcriptomique a également permis d’identifier en tant que nouvelle cible de NRF2, un second facteur de transcription, décrit comme régulateur de l'expression des collagènes et impliqué dans une maladie du tissu conjonctif. Le marquage de ce facteur par immunofluorescence a révélé que sa localisation subcellulaire, et en particulier sa translocation, est affectée par la sous-expression de NRF2 (siRNA et shRNA). Nos résultats montrent ainsi que la sous-expression de NRF2 dans les fibroblastes cutanés humains impacte les gènes de la MEC et en particulier l’expression des collagènes. Le second facteur de transcription identifié pourrait être un intermédiaire ou un co-facteur spécifique de NRF2 impliqué dans la régulation de l’expression des gènes de la MEC. NRF2 peut ainsi être considéré comme nouveau régulateur des gènes de la MEC dans les fibroblastes cutanés humains et représente une nouvelle cible pour maintenir l'homéostasie du derme.

The nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (NRF2) is a transcription factor involved in cell defense against oxidative and xenobiotic stresses. SKN-1, the nematode homologue of NRF2 is a master regulator of longevity that, under specific metabolic conditions, surprisingly acts through the activation of collagens expression. Fibroblasts are the major producers and organizers of collagen-rich tissues and, as such, play a key role in dermis homeostasis. Therefore, we investigated the potential new role of NRF2 in regulating extracellular matrix (ECM) expression in human skin fibroblasts. Dysregulation of NRF2 was realized using siRNA and shRNA. A global transcriptomic analysis of siNrf2 human skin fibroblasts performed by RNA-seq revealed that, in addition to known NRF2 targets, matrisome and tissue skeleton genes were the most represented gene sets, including some key ECM genes. Analysis of ECM production and organization was further conducted in cultured shNrf2 fibroblasts using a combination of microscopies (SHG, confocal, TEM and AFM). Long-term effect of silencing NRF2 in fibroblasts (shNrf2) resulted in defects in collagen expression and fibril formation, likely due to a disturbed collagen I to collagen V ratio. Interestingly, a transcription factor involved in connective tissue disease and described as a regulator of collagen expression was identified as a novel target of NRF2. Immunofluorescence staining of silenced NRF2 fibroblasts (siRNA and shRNA) strikingly revealed that NRF2 downregulation impacts its translocation rate into the nucleus. Our results demonstrate that silencing NRF2 impacts ECM and especially collagens in human skin fibroblasts. A transcription factor known to regulate collagen expression, could act as a specific cofactor of NRF2 in the regulation of ECM gene expression. NRF2 can thus be considered as a novel regulator of ECM genes in human skin fibroblasts and represents a new target to maintain dermis homeostasis.