Identification and functional characterization of post-translational modifications of the Leucin Rich Repeat (LRR) domain of NLRP3

par Tingting Niu

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Bénédicte Py et de Jiemin Wong.

Soutenue le 09-07-2020

à Lyon en cotutelle avec l'East China normal university (Shanghai) , dans le cadre de École Doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon) , en partenariat avec École normale supérieure de Lyon (établissement opérateur d'inscription) .

Le président du jury était Thomas Henry.

Le jury était composé de Bénédicte Py, Jiemin Wong, Thomas Henry, Damien Arnoult, Étienne Meunier, Virginie Petrilli.

Les rapporteurs étaient Damien Arnoult, Étienne Meunier.

  • Titre traduit

    Identification et caractérisation fonctionnelle des modifications post-traductionnelles du domaine Leucin Rich Repeat (LRR) de NLRP3


  • Résumé

    La réponse immunitaire innée est la première ligne de défense contre les infections et les signaux de danger. Elle est déclenchée par l’activation de récepteurs via la reconnaissance de motifs conservés spécifiques des pathogènes appelés PAMP (Pathogen-Associated Molecular Patterns) et/ou de signaux de danger endogènes appelés DAMP (Damage-Associated Molecular Patterns). Parmi eux, NLRP3 (NACHT, leucine-rich repeat (LRR), and pyrin domain (PYD) -containing 3) assemble un complexe de signalisation appelé inflammasome, qui contrôle la sécrétion d’IL-1β, d’IL-18 et la mort cellulaire par pyroptose. La dérégulation de l’inflammasome NLRP3 est impliquée dans plusieurs maladies. Les modifications post-traductionnelles (PTM) sont essentielles à l’activation de cet inflammasome, en particulier la déubiquitination du domaine LRR de NLRP3 par BRCC3. Notre but est de mieux comprendre les mécanismes de régulation des PTM au niveau du domaine LRR de NLRP3. En utilisant la spectrométrie de masse, nous avons identifié 3 lysines ubiquitinées et 3 sérines phosphorylées. La sécrétion d’IL-1β et d’IL-18 est significativement diminuée dans les lignées cellulaires humaines et murines reconstituées exprimant les mutants de substitution des lysines ubiquitinées de NLRP3. Cela supporte que ces sites sont importants pour l’activation de l’inflammasome NLRP3. L’impact de ces ubiquitinations devra être confirmé en cellules primaires et in vivo. En parallèle, une des sérines phosphorylées est aussi importante pour l’assemblage de l’inflammasome dans les lignées cellulaires reconstituées ainsi que dans les BMDM issus des souris knock-in portant une substitution phosphomimétique de cette sérine. Concernant le mécanisme, la substitution S/D conduit à l’hyper-ubiquitination de NLRP3 et empêche son activation via l’altération du recrutement de BRCC3. Par conséquent, nous avons découvert un nouveau point de contrôle en amont du recrutement de BRCC3. De plus, nous avons identifié 4 kinases comme candidats pouvant cibler cette sérine et nous avons aussi mis en évidence par un screen siRNA des phosphatases régulant l’inflammasome NLRP3. Dans le futur, cibler cette phosphorylation pourrait être utilisé comme une nouvelle voie thérapeutique pour les traitements anti-inflammatoires.


  • Résumé

    Innate immune response is the first line of defense against infections and damages and is triggered by dedicated receptors activated by pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and/or damage-associated molecular patterns (DAMPs). Among them, NACHT, leucine-rich repeat (LRR), and pyrin domain (PYD) -containing 3 (NLRP3) assembled the inflammasome signaling complex that controls the secretion of IL-1β and IL-18 and cell death by pyroptosis. Dysregulation of NLRP3 inflammasome is involved in many diseases. The post-translational modifications (PTMs) are essential for NLRP3 inflammasome activation, in particular deubiquitination of NLRP3 LRR by BRCC3. Our goal is to better understand the regulation mechanism of PTMs in NLRP3 LRR domain. Using mass spectrometry, we identified 3 ubiquitinated lysines and 3 phosphorylated serines. The IL-1β and IL-18 secretion were significantly decreased in reconstituted human and mouse cell lines expressing NLRP3 mutants bearing substitutions of the ubiquitinated lysines, supporting that these sites are important for NLRP3 inflammasome activation. The impact of these ubiquitinations will need to be confirmed in primary cells and in vivo. Similarly, one of the phosphorylated serines is critical for inflammasome assembly in reconstituted cell lines, as well as in primary bone marrow derived macrophages from in-house generated knock-in mice bearing a phosphomimetic substitution of this serine. Mechanistically, S/D substitution leads to NLRP3 hyper-ubiquitination and suppresses NLRP3 inflammasome activity via impairing BRCC3 recruitment. Therefore, we discovered an additional checkpoint upstream of BRCC3 recruitment. Besides, we identified 4 kinases as candidates to target this serine and identified by siRNA screen phosphatases regulating the NLRP3 inflammasome pathway. In the future, targeting this phosphorylation could be used as a novel therapeutical target for anti-inflammatory drugs.



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