Caractérisation de protéines effectrices bactériennes

Molecular characterisation of new bacterial effectors

• Auteur / Autrice : Arthur Louche
• Direction : Suzana Salcedo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Infectiologie
• Date : Soutenance le 16/12/2020
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Molecular Microbiology and Structural Biochemistry (Lyon ; 1999-....)
• Jury : Président / Présidente : Patrice Gouet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Suzana Salcedo, Matteo Bonazzi, Agathe Subtil, Xavier de Bolle
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Matteo Bonazzi, Agathe Subtil

Mots clés

Mots clés contrôlés

Infections à Pseudomonas aeruginosa

Ribosomes

Brucella

Agents pathogènes

Mots clés libres

Brucella

Interaction hôte pathogène

Effecteur protéique

Brucellose

Brucella

Host-pathogen interaction

Protein effector

Brucellosis

Résumé

Les agents pathogènes intracellulaires ont la capacité de moduler les réponses cellulaires de l'hôte pour survivre et proliférer. Ceci est réalisé en produisant et en injectant des protéines effectrices dans les cellules hôtes. Ces effecteurs peuvent notamment moduler la réponse immunitaire et le trafic intracellulaire. Brucella, l'agent causal de la brucellose, maladie transmissible de l'animal à l'homme, délivre des effecteurs dans la cellule hôte via son système de sécrétion de type IV. À ce jour, seuls quelques effecteurs ont été identifiés chez Brucella et leurs fonctions moléculaires restent floues. Au cours de ma thèse, nous nous sommes intéressés à deux effecteurs de Brucella abortus contenant un domaine TIR, BtpA et BtpB, connues pour moduler la réponse immunitaire innée de l'hôte. Cependant, il a été démontré récemment que les domaines TIR purifiés ont une activité NADase in vitro. Nous avons ainsi montré que BtpA et BtpB conservent cette activité et sont capables de réduire la quantité de NAD présente dans la cellule hôte pendant l'infection. Ces résultats suggèrent que la NAD intracellulaire joue un rôle dans les infections à B. abortus et pourrait constituer un nouveau mécanisme de pathogénie. Parallèlement à ce projet, j'ai également eu l'occasion de travailler sur la caractérisation d'effecteurs contenant un domaine TIR chez d'autres agents pathogènes. J'ai apporté une contribution majeure à la caractérisation de l'effecteur PumA chez Pseudomonas aeruginosa et participé à la caractérisation de l'effecteur TirS chez Staphylococcus aureus. Le projet principal de ma thèse était d'initier une caractérisation structurale et fonctionnelle de deux nouveaux effecteurs de B. abortus, que nous avons nommés NyxA et NyxB. Après avoir établi qu'ils sont transloqués dans la cellule hôte pendant l'infection, nous avons observés ces effecteurs dans des compartiments nucléaires et cytosoliques. Par des expériences de co-précipitation, nous avons montré que ces deux effecteurs sont capables d'interagir entre eux et nous avons identifié SENP3 comme leur cible eucaryote. SENP3 est une déSUMOylase essentiellement située dans un sous-compartiment nucléaire, le nucléole. Cette protéine est impliquée dans la régulation de nombreuses fonctions cellulaires et joue un rôle majeur dans la biogenèse des ribosomes. Nous avons montré que SENP3 est nécessaire à la réplication de B. abortus dans la cellule hôte. L'analyse structurale de NyxB, nous a permis d'identifier une poche acide impliquée dans l'interaction avec SENP3. Etonnamment, dans les cellules infectées par B.abortus, SENP3 est délocalisée et ne s'accumule plus dans les nucléoles. Dans les cellules transfectées par NyxA et NyxB, nous avons observé que ces deux effecteurs recrutent SENP3 dans un autre compartiment nucléaire : les corps nucléaires PML. En outre, ces effecteurs modulent également la distribution de NVL et RPL5, composants clés de la machinerie de biogénèse ribosomique dans les nucléoles, qui dans les cellules infectées forment des structures punctiformes dans le cytosol de manière dépendante de SENP3. Nous avons observé que ces structures cytosoliques correspondent à la localisation cytosolique des effecteurs Nyx et sont également enrichies en NUFIP1, un récepteur de la ribophagie. Des résultats préliminaires suggèrent que ces deux effecteurs Nyx sont capables de moduler la biogenèse des ribosomes, ce qui a un impact sur la synthèse des protéines. En résumé, ce deuxième projet identifie deux nouveaux effecteurs chez B. abortus, qui ont un impact sur la localisation nucléolaire de SENP3. Ils sont impliqués dans la formation de structures cytosoliques enrichies en NUFIP1, NVL et RPL5, ce qui suggère un processus similaire à celui de la ribophagie. De plus, les effecteurs Nyx sont les premiers effecteurs bactériens qui modulent directement la localisation subcellulaire des protéines nucléolaires et qui ont un impact sur la biogenèse des ribosomes pendant l'infection

Intracellular pathogens have the ability to modulate the hosts’ cellular responses to survive and proliferate. This is achieved by producing and injecting effector proteins into host cells. These effectors can modulate various cellular functions, including immune response and intracellular trafficking. Brucella, the causative agent of brucellosis, an animal disease transmissible to humans, delivers effector proteins into the host cell through its type IV secretion system. To date, only a few effectors have been identified in Brucella and their molecular functions remain unclear. During my thesis, we were particularly interested in two Brucella effector proteins containing a TIR domain, BtpA and BtpB, known to modulate the host innate immune response. However, more recently, purified TIR domains were also shown to have NADase activity in vitro. We have thus shown that BtpA and BtpB retain this activity and are able to reduce the amount of NAD present in the cell host during infection. These results suggest that intracellular NAD plays a role in Brucella infections and may constitute a new mechanism for Brucella pathogenicity. In parallel to this project, I also had the opportunity to work on the characterization of TIR-domain-containing effectors in other pathogens. I have made a major contribution to the characterization of the PumA effector in Pseudomonas aeruginosa and participated in the to characterization of the TirS effector in Staphylococcus aureus. The major project of my thesis was to initiate a structural and functional characterization of two new B. abortus effectors, which we named NyxA and NyxB. After establishing they were translocated into the host cell during infection, we imaged these effectors and found them in nuclear and cytosolic compartments. By pull-down experiments, we showed that these two effectors were able to interact with each other and we identified SENP3 as their eukaryotic target. SENP3 is a deSUMOylase essentially located in a nuclear sub-compartment, the nucleolus. This protein is involved in the regulation of many cellular functions and plays a major role in ribosome biogenesis. We have shown that SENP3 is necessary for the replication of B. abortus within the host cell. The structural analysis of NyxB allowed us to identify an acidic pocket involved in the interaction with SENP3. Surprisingly, in cells infected with B. abortus, SENP3 is delocalized and no longer accumulating in nucleoli. In NyxA and NyxB transfected cells we could observe these two effectors recruited SENP3 to another nuclear compartment: the PML nuclear bodies. Furthermore, these effectors were also able to modulate the distribution of NVL and RPL5, key components of the ribosomal biogenesis machinery in the nucleoli, which in infected cells form cytosol punctate structures in a manner dependent on SENP3. We have observed that these cytosolic structures correspond to the cytosolic location of Nyx effectors and are also enriched in NUFIP1, a ribophagy receptor. Preliminary results suggest that these two Nyx effectors are capable of modulating ribosomal biogenesis, impacting protein synthesis. In summary, this second project identifies two new Brucella effectors, which have an impact on the nucleolar localization of SENP3. They are involved in the formation of cytosolic structures enriched in NUFIP1, NVL and RPL5 suggesting a process similar to that of ribophagy. Moreover, the Nyx effectors are the first bacterial effectors directly modulating subcellular localization of nucleolar proteins and impacting ribosomal biogenesis during infection