Régulations transcriptionnelles des gènes de l’inflammasome par les Interferon Regulatory Factors

Transcriptional regulations of inflammasome-related genes by Interferon Regulatory Factors

• Auteur / Autrice : Maxence Cornut
• Direction : Thomas Henry
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Infectiologie
• Date : Soutenance le 04/12/2020
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon ; 1999-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre international de recherche en infectiologie (Lyon ; 2013-....)
• Jury : Président / Présidente : Fabienne Venet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Thomas Henry, Laurent Boyer, Céline Cougoule, David Masson
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Laurent Boyer, Céline Cougoule

Mots clés

Mots clés contrôlés

Inflammation

Mort cellulaire

Immunité

Interférons

Mots clés libres

Inflammasome

Interferon Regulatory Factors

Interferon

Immunité

Francisella

Pyroptose

Régulations transcriptionnelles

Inflammasome

Interferon Regulatory Factors

Interferon

Immunity

Francisella

Pyroptosis

Transcriptional regulations

Résumé

Les Interferon Regulatory Factors sont une large famille de facteurs de transcription premièrement identifiés dans la régulation du gène de l’interféron β. Ces facteurs de transcription ont été décrits dans beaucoup de mécanismes de l’immunité, innée comme adaptative. Ils sont grandement impliqués dans la régulation de l’expression ainsi que la réponse aux interférons de type 1. Ils jouent également divers rôles dans la différentiation et la maturation des cellules de l’immunité, qu’elles soient d’origine myéloïde ou lymphoïde. De récentes publications ont mis en valeur le rôle de deux membres de cette famille, IRF1 et IRF2, dans la régulation de gènes associés à l’inflammasome. L’inflammasome est un complexe multiprotéique impliqué dans la reconnaissance de signaux de dangers émis par des agents pathogènes ou des cellules entrain de mourir. L’inflammasome est constitué d’une épine dorsale peu variable constituée d’un senseur, un adaptateur et un effecteur. L’activation de l’inflammasome aboutit donc à l’activation de l’effecteur, membre de la famille des caspases. La caspase-1 induit la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, IL-1β et IL-18, ainsi qu’une mort cellulaire inflammatoire programmée nommée pyroptose via le clivage d’une protéine : la gasdermin D. La première partie de ma thèse a constitué en l’identification de partenaires des guanylates binding proteins, protéines impliquées dans la lyse des bactéries cytosoliques, ainsi qu’en la définition de l’état d’ubiquitination de ces protéines lors de la réponse à Francisella. Cette piste n’aboutissant pas, j’ai réorienté ma thèse sur la suite des travaux publiés par le laboratoire sur la régulation de CASP4 par le facteur de transcription IRF2, identifié par un screen CRISPR/Cas9 à l’échelle du génome. Grâce aux travaux préliminaires de Sacha BENAOUDIA, nous avons pu identifier dans un modèle murin Irf2-/- développé par nos soins une régulation négative in vitro ainsi qu’in vivo de l’expression de gasdermin D. Nous avons par la suite défini dans un modèle in vitro de macrophages murins dérivés de moëlle osseuse l’impact de cette régulation négative de l’expression de Gsdmd exercée par l’absence d’Irf2 sur le fonctionnement de l’inflammasome. Nous avons pu observer que les conséquences de l’inflammasome, à savoir la mort cellulaire et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, étaient diminuées dans notre modèle murin Irf2-/- quand comparé à des cellules d’animaux Wild-Type. Des différences de régulation de CASP4 et GSDMD par IRF2 ayant été mises en évidence par deux équipes dont la nôtre, nous avons ensuite exploré la fixation d’IRF2 sur les séquences promotrices de gènes liés à l’inflammasome que sont CASP1, CASP4 et GSDMD. Nous avons identifié quatre profils de fixation différents dans les quatre types cellulaires étudiés. Nous avons enfin souhaité définir les rôles d’IRF1 et IRF2 par rapport au 3 gènes cités précédemment dans des lignées humaines utilisées dans le champ inflammasome et élucider les différences de fixation et d’expression de ces gènes type-cellulaire dépendante. Ces quelques résultats nous ont permis de conclure que, dans la souris, Gsdmd est régulée par Irf2. La délétion d’Irf2 dans ces animaux induit une susceptibilité à Francisella novicida conduisant à une mort prématurée des animaux infectés. Chez l’Homme, la régulation de GSDMD semble plus complexe, dépendant entre autres d’IRF2 ainsi que d’IRF1. Des différences d’expression à steady state et d’induction des gènes de l’inflammasome par l’IFNγ existent en fonction des types cellulaires, soulignant l’importance du choix de l’outil choisi lors des expérimentations dans ce champ. Nous n’aurons pas pu définir le rôle exact d’IRF1 et IRF2 dans la régulation des gènes de l’inflammasome, mais les résultats générés suggèrent déjà des régulations type-cellulaire dépendantes.

Interferon Regulatory Factors are a large family of transcription factors firstly identified in the regulation of interferon β gene expression. These transcription factors have been described in many innate and adaptive immunity mechanisms. They are widely involved in regulation of expression and response to type 1 interferons. They are also involved in many steps of differentiation and maturation of immune cells, either myeloid or lymphoid. Recent publications highlighted IRF1 and IRF2 roles, both members of this transcription factor family, in the regulation of inflammasome-related genes. Inflammasome is a multiproteic complex involved in the detection of danger signals provided by either invading pathogens or dying cells. Inflammasome is made of a rarely variable backbone including a sensor, an adaptor and an effector. Inflammasome activation results in activation of an effector, member of the caspase family. Caspase-1 induces pro-inflammatory cytokines secretion, IL-1β and IL-18, as well as a programmed inflammatory cell death termed pyroptosis by cleaving one specific protein: gasdermin D. The first part of my thesis concerned the identification of guanylate binding proteins partners, proteins involved in cytosolic bacteria lysis. I also tried to define the ubiquitination state of these proteins in Francisella-infected cells. These leads did not give any promising results so I reoriented my work. I continued previously published work from our lab on CASP4 regulation by transcription factor IRF2, identified thanks to a genome-wide CRISPR/Cas9 screen. Thanks to preliminary work realized by Sacha BENOUDIA, we identified in a newly-created Irf2-/- murine model a negative regulation both in vivo and in vitro of Gsdmd expression. We then defined in vitro in bone marrow derived macrophages how inflammasome functions are impacted by the absence of Gsdmd in Irf2-/- cells. We observed that the outcomes of inflammasome, cell death and proinflammatory cytokines secretion, were diminished in Irf2-/- cells when compared to Wild-Type cells. Regulation differences of CASP4 and GSDMD by IRF2 were brought out by two different teams, including ours. We then decided to explore IRF2 binding to inflammasome-related genes promoters: CASP1, CASP4 and GSDMD. We identified four different binding profiles in the four cell types studied. We finally wanted to properly define IRF1 and IRF2 roles in the regulation of the three precedingly cited genes in human cell lines commonly used in the inflammasome field and elucidate cell-type specific binding differences and gene expression. These few results allowed us to conclude that, in mice, Gsdmd expression is regulated by Irf2. Irf2 deletion in our animals induces a susceptibility to Francisella novicida infection leading to an early death of these animals. In Humans, GSDMD regulation seems to be more complex, with the involvement of both IRF1 and IRF2. Differences in inflammasome-related gene expression at steady state and differences in induction after IFNγ treatment remind the importance of proper tool choice in this field. We did not manage to define the exact role of IRF1 and IRF2 in the regulation of inflammasome-related genes, but the presented results already suggest cell-type dependent regulations.