PCR multiplexe et biopuce pour la détection rapide d’agents infectieux

Microarrays and Multiplex PCR for the identification and characterization of pathogens

• Auteur / Autrice : Laëtitia Villiers
• Direction : Christophe A. Marquette
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 08/10/2020
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires (Villeurbanne, Rhône)
• Jury : Président / Présidente : Loïc Blum
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christophe A. Marquette, Emmanuelle Laurenceau, Franck Molina, Max Maurin, Carole Chaix
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Emmanuelle Laurenceau, Franck Molina, Max Maurin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bactériémie

Résistance aux antibiotiques

Biopuces

Diagnostic immunologique

Mots clés libres

Sepsis

Bactériémie

Antibiorésistance

Biopuces

PCR Multiplexe

Plateforme automatisée

Test de diagnostic

Bloodstream Infection

Sepsis

Antimicrobial resistance

Multiplex PCR

Microarray

Automated platform

Diagnostic test

Résumé

Les travaux présentés dans cette thèse ont été réalisés dans le cadre projet Européen H2020 FAPIC (« Fast Assay for Pathogen Identification and Characterization »), dont le but est de développer deux outils de diagnostic automatisés. Chacun permet l’identification au sein d’un seul test de 53 pathogènes et genres bactériens ainsi que l’identification de 40 gènes de résistance, directement à partir d’échantillons de sang. La première partie du travail présenté dans ce manuscrit concerne le processus de sélection des cibles génétiques qui seront détectées avec ce test et la conception des sondes et des amorces ainsi que l’optimisation des protocoles de PCR multiplexes et d’hybridation sur les biopuces. Une deuxième partie de ce manuscrit concerne le développement du logiciel d’analyse afin d’identifier les pathogènes et gènes de résistance à partir des images obtenues sur les biopuces. La reconnaissance des cibles s’effectue à l’aide de seuils d’intensités et/ou à un système de reconnaissance de signatures spécifiques associées à chaque pathogène. La troisième partie des travaux décrit les performances de ce test et l’identification des cibles à partir d’ADN extrait de souches bactériennes, puis provenant d’échantillons de sang artificiellement contaminés et enfin à partir d’échantillons cliniques de patient

The work presented in this thesis is part of the European project H2020 FAPIC (Fast Assay for Pathogen Identification and Characterization), which aims to develop two automated diagnostic platforms, allowing the identification of 53 pathogens and bacterial genus as well as the identification of 40 resistance genes, directly from blood samples and within a single test. The first part of the work presented in this manuscript concerns the selection process of the genetic targets that will be identified in this test, the design of primers and probes and the optimization of the protocols of the multiplex PCR and microarrays. The second part of this manuscript concerns the development of the analysis software in order to identify pathogens and resistance genes from pictures of the microarrays. The recognition of the targets is carried out through the use of intensity thresholds and/or using a recognition system, specific towards patterns associated with each pathogen. The third part of this work describes the test performance and the identification of the targets from extracted bacterial strains DNA, then using samples artificially contaminated blood sample and finally using clinical blood samples from patient