Polycétide synthases : étude de l’influence de l’organisation macromoléculaire sur la fonction par ingénierie génétique

Polyketide synthases : probing the effect of macromolecular organization on function by genetic engineering

• Auteur / Autrice : Jean-Malo Massicard
• Direction : Kira Weissman, Christophe Jacob
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 18/12/2020
• Etablissement(s) : Université de Lorraine
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale BioSE - Biologie, Santé, Environnement
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Ingénierie moléculaire et physiopathologie articulaire (Vandœuvre-lès-Nancy)
• Jury : Président / Présidente : Bertrand Aigle
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Kira Weissman, Christophe Jacob, Valérie Leclère, Yanyan Li, Muriel Gondry, Jean-Luc Pernodet
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Valérie Leclère, Yanyan Li

Mots clés

Mots clés contrôlés

Dissertation universitaire

Polyketide synthases

Complexes multienzymatiques

Stéréochimie

Génie génétique

Métabolites

Synthèse (chimie)

Acétogénines

Mots clés libres

Polycétide synthases

Ingénierie génétique/biologie synthétique

Stéréochimie

Macrocomplexes enzymatiques

Polyketide synthases

Genetic engineering/synthetic biology

Stereochemistry

Macroenzyme complexes

Résumé

Les polycétides – des métabolites secondaires bactériennes à forte valeur médicale – sont synthétisées par des méga-enzymes multi-modulaires appelées polycétide synthases (PKS). Cette thèse a eu pour objectif d’employer des outils d’ingénierie pour évaluer l’effet du contexte macromoléculaire sur le fonctionnement des PKS à deux niveaux. D’abord, afin d’évaluer l’influence du contexte modulaire sur le stéréocontrôle exercé par certains domaines, les échanges de modules ont été effectués au sein de notre système PKS modèle. Ces modules ont été introduits par un système de recombinaison homologue chez la levure en suivant plusieurs stratégies d’échange de modules. Puis l’expression de ces protéines hybrides a été effectuée chez Saccharopolyspora erythraea, suivie par l’analyse des produits par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse. Nos résultats suggèrent que l’échange de module entier serait plus efficace car il permet de préserver les contacts entre les domaines KS et ACP d’un même module, afin de maintenir une réaction de condensation décarboxylative efficace. De plus, l’échange de module interne à une sous-unité est plus efficace, car le domaine KS de ce type de module possède une spécificité de substrat plus grande. Concernant l’organisation macromoléculaire des PKS, il a été décrit que la PKS de type trans-AT responsable de la synthèse de la bacillaene chez Bacillus subtilis s’assemblent pour former un mégacomplexe, et que ce mégacomplexe se localise proche de la membrane interne. Ces découvertes doivent être généralisées à la deuxième grande classe de PKS, celle des PKS de type cis-AT. Pour pouvoir localiser la PKS de type cis-AT responsable de la synthèse de la coelimycine (Cpk) au sein de son hôte natif Streptomyces coelicolor, nous avons fusionné la première et/ou la dernière sous-unité de Cpk à une protéine fluorescente. La création des fusions de protéine a été effectuée avec l’outil d’ingénierie génétique CRISPR/Cas9. Par la suite, nous avons obtenu des images de la localisation des protéines de fusion par microscopie confocale. Nous montrons pour la première fois que les sous-unités d’une PKS de type cis-AT se localisent également en macrocomplexes, mais que ce type de PKS possèderait une organisation macromoléculaire différente. Nous montrons également la colocalisation d’une des sous-unités de Cpk avec le transporteur CpkF associé, afin d’évaluer la formation d’une véritable usine biosynthétique.

The polyketides, medically valuable bacterial secondary metabolites, are synthesized by multimodular mega-enzymes called polyketide synthases (PKSs). The goal of this work has been to exploit genetic engineering tools including CRISPR/Cas9 to evaluate the effect of macromolecular context on the function of PKSs at two molecular levels. In order to assess the influence of the modular context on the stereocontrol exerted by certain domains, the module exchanges were carried out within our model PKS system. These modules were introduced by a homologous recombination system in yeast following several module exchange strategies. The expression of these hybrid proteins was then performed in Saccharopolyspora erythraea, followed by analysis of the products by gas chromatography coupled with mass spectrometry. Our results suggest that whole-module-to-whole-module exchange would be more efficient because it preserves contacts between the KS and ACP domains of the same module, to maintain an efficient decarboxylative condensation reaction. In addition, the module exchange internal to a subunit is more efficient, because the KS domain of this type of module has a greater substrate specificity. The modules which showed the most significant results were then used to modify an entire PKS to attempt for the first time to modify the stereochemistry of the erythromycin intermediate. Regarding the macromolecular organization of PKS, it has been described that the trans-AT-type PKS responsible for the synthesis of bacillaene in Bacillus subtilis assemble to form a mega-complex, and that this mega-complex is localized close to the inner membrane. These findings should be generalized to the second major class of PKS, that of cis-AT-type PKS. To be able to locate the cis-AT-type PKS responsible for the synthesis of coelimycin (Cpk) within its native host Streptomyces coelicolor, we fused the first and / or the last subunit of Cpk to a fluorescent protein. Creation of the protein fusions was performed with the CRISPR / Cas9 genetic engineering tool. Subsequently, we obtained images of the localization of the fusion proteins by confocal microscopy. We show for the first time that the subunits of a cis-AT-like PKS also localize in macrocomplexes but present a different macromolecular organization. We also show the colocalization of one of the Cpk subunits with the associated CpkF transporter, to assess the formation of an authentic biosynthetic factory.