Etude de l'impact de la mutation H3.3K27M sur le phénotype agressif et résistant de lignées cellulaires de gliome pédiatrique

Impact of H3.3K27M mutation on the aggressive and resistant phenotype of pediatric glioma cell lines

• Auteur / Autrice : Quentin Bailleul
• Direction : Samuel Meignan
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biomolécules, pharmacologie, thérapeutique
• Date : Soutenance le 04/12/2020
• Etablissement(s) : Université de Lille (2018-2021)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Hétérogénéité, plasticité et résistance aux thérapies des cancers (CANTHER)
• Jury : Président / Présidente : Xuefen Le Bourhis
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pascale Varlet, Eddy Pasquier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Hélène Castel, Marie-Anne Debily

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mutation (biologie)

Épigénétique

Histones

Cancer

Tronc cérébral

Résistance aux médicaments

Chez l'enfant

Gliomes

Mots clés libres

Résistance à la radiothérapie

Édition du génome

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma

Résumé

Les DIPG (Diffuse Intrinsic Pontine Glioma) sont des tumeurs cérébrales pédiatriques au pronostic des plus sombres, et ce notamment du fait de la résistance des cellules aux différents traitements de chimio et de radiothérapie. Une des caractéristiques majeures des cellules de DIPG est qu’elles sont quasi systématiquement porteuses d’une mutation mono-allélique de l’histone H3 au niveau de sa lysine 27, et ce majoritairement sur le variant d’histone H3.3. Cette mutation, H3.3K27M, inhibe la triméthylation en K27 de l’histone H3 (H3K27me3) par un effet dominant négatif, ayant pour conséquence une réorganisation de la chromatine et ainsi une modification profonde de l’expression des gènes. Actuellement, et bien que les mutations H3K27M soient décrites comme étant un élément « driver » dans la genèse des DIPG, leur implication dans la résistance aux traitements n’a toutefois pas été pleinement établie. Afin de décrypter finement les implications de la mutation H3.3K27M, l’établissement de modèles cellulaires complémentaires d’induction mais aussi de réversion de la mutation apparaissait nécessaire.Dans ce contexte, j’ai, par transfection plasmidique, induit la mutation H3.3K27M dans trois lignées cellulaires de gliome pédiatrique sustentoriel initialement non mutées. De façon complémentaire, j’ai créé un modèle de réversion de la mutation dans des cellules de DIPG mutées H3.3K27M par la mise en place d’une stratégie utilisant le système CRISPR/Cas9, générant une cassure double brin au niveau du site de la mutation, combinée à une approche de « gene trapping » visant à restaurer la forme sauvage du gène H3F3A. Ces deux stratégies d’induction et de réversion de la mutation nous ont permis de constituer un ensemble de modèles cellulaires disponible avec et sans la mutation H3.3K27M. Fort de ceux-ci, j’ai pu entreprendre d’évaluer le rôle exact de la mutation H3.3K27M sur la résistance aux traitements de chimio et radiothérapie, la croissance cellulaire ou encore les propriétés clonogéniques.Concernant le modèle d’induction, les effets épigénétiques liés à la mutation étaient confirmés au sein des trois lignées cellulaires établies. La présence de la mutation avait alors un effet sur la croissance cellulaire dans deux des trois lignées cellulaires, et ce concomitamment avec un pouvoir clonogénique accru par l’introduction de la mutation. Ces mêmes lignées cellulaires présentaient une résistance supérieure à la radiothérapie et un screening de chimiothérapies permettait de mettre en évidence plusieurs composés pour lesquels la mutation H3.3K27M conférait une résistance. D’un point de vue plus global, il semblerait que la mutation confère un caractère agressif et résistant principalement dans un contexte de gliome de bas grade. En parallèle, j’ai pu valider la création d’un modèle de réversion de la mutation dans une lignée cellulaire de DIPG originellement mutée. Dans celui-ci, les cellules ne diffèrent que par l’absence de la mutation et présentent un retour de la marque H3K27me3. Une évaluation préliminaire des effets de la réversion de la mutation tendait à confirmer ceux obtenus avec le modèle d’induction.Le décryptage des mécanismes sous-jacents aux effets biologiques observés, nous permettra d’évaluer et de comprendre pleinement le rôle de la mutation H3.3K27M dans l’agressivité et la résistance aux traitements des DIPG et d’identifier de possibles nouvelles stratégies de traitement des gliomes malins pédiatriques du tronc cérébral.

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma is one of the worst pediatric brain tumors regarding prognosis due to cell resistance to chemo and radiotherapy. One of DIPG cells main characteristics is a mono-allelic mutation on the lysine 27 of histone H3 (H3K27M). This mutation inhibits the trimethylation of this lysine that leads to strong modifications of gene expression. Even though this mutation seems to be a driver event in tumorigenesis, its role in cell resistance to treatment has not been deciphered. To accomplish this, we needed to establish complementary cellular models of induction but also the reversion of the mutation.This way, to evaluate the role of the mutation on resistance to treatment, we first induced the mutation in three H3K27-unmutated pediatric glioma cell lines. In parallel, using the CRISPR/Cas9 technology and gene trapping approaches, we establish DIPG cellular models in which the mutation has be reversed to restore an H3F3A wild type gene. These two strategies allowed us to have a panel of available cellular models with or without mutation. Basis on these models, we evaluated the precise role of H3.3K27M mutation on chemo and radioresistance but also on cell growth and clonogenic properties.For the model of induction, we confirmed the epigenetics impact of the mutation. Next, we showed an increased cell growth due to the mutation in two cell lines, concomitantly with an increase of clonogenic properties. H3.3K27M mutation had an impact on resistance to both chemotherapy or ionizing radiation in the same cell lines. We could identify several drugs for which the mutation increases cell resistance. We observed that H3.3K27M could improve cell resistance and aggressiveness, especially in a low-grade glioma context. Concerning the mutation reversion, we validated the loss of the mutation in one DIPG cell line. In this way, we succeeded in restoring the H3K27me3 mark. Our preliminary assays on cell growth and clonogenic properties exhibit results that are in adequacy with those obtained on the induction model.To sum up, these different models would allow us to decipher cellular and molecular mechanisms induced by the H3.3K27M mutation in DIPG cells, including resistance to treatment, and possibly identify putative therapeutic targets.