Evaluation de la stabilité de l’insuline humaine dans un mélange de nutrition parentérale ternaire : études in vitro et in vivo

In vitro and in vivo stability study of human insulin in ternary parenteral nutrition admixture

• Auteur / Autrice : Héloïse Henry
• Direction : Thierry Dine
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacie en sciences du médicaments et des autres produits de santé
• Date : Soutenance le 31/03/2020
• Etablissement(s) : Université de Lille (2018-2021)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Groupe de Recherche sur les formes Injectables et les Technologies Associées (Lille) - Groupe de Recherche sur les formes Injectables et les Technologies Associées - ULR 7365
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pascal Odou, Damien Lannoy, Arnaud Agin, Catherine Foulon
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sylvie Crauste-Manciet, Francisca Joly Gomez

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spectrométrie de masse

Nutrition parentérale

Insuline ordinaire humaine

Spectrométrie de masse

Glycosylation

Alimentation parentérale

Insuline

Mots clés libres

Insuline humaine

Nutrition parentérale

Stabilité

Méthodes immonométriques / immunodosages

Spectrométrie de masse

Glycation

Human insulin

Parenteral nutrition solutions

Stability

Immunoassays

Mass spectrometry

Glycation

Résumé

La dénutrition est un problème de santé publique qui fait l’objet d’une politique nationalecomportant parmi les objectifs, la prévention et le traitement de cette affection. L’administrationde nutrition parentérale (NP) comporte parmi ses effets indésirables métaboliques majeurs,l’hyperglycémie. Celle-ci augmente la morbi-mortalité des patients recevant de la NP, que ce soità l’hôpital ou au domicile. L’administration d’insuline doit par conséquent accompagner celle dela NP. L’ajout direct d’insuline humaine dans la poche de NP n’est recommandé que lorsque lastabilité de l’insuline d’une part et du mélange de NP d’autre part ont été démontrées.L’objectif principal de ces travaux de thèse est de déterminer la stabilité de l’insuline humaine etdu mélange de NP ternaire lorsqu’ils sont mis en présence l’un de l’autre.Afin d’atteindre cet objectif, les études suivantes sont mises en oeuvre : 1) évaluation de lastabilité physique du mélange de NP ternaire 2) validation d’une méthode immunométrique dequantification de l’insuline humaine afin de doser l’insuline sur une durée de 24 heures aprèsajout dans un mélange industriel de nutrition parentérale ternaire supplémenté en vitamines etéléments-trace puis d’étudier l’impact de différents facteurs (composition en macronutritments,conditionnement, pH…) sur l’évolution de la concentration en insuline dans ce mélangecomplexe 3) validation d’une méthode de chromatographie liquide haute performance avecdétection par spectrométrie de masse en tandem afin de quantifier l’insuline et détecterl’insuline glyquée dans un mélange de NP binaire au cours d’une cinétique de 24 heures 4)étude de la bioactivité de l’insuline à l’aide d’un protocole d’expérimentation animale,permettant de comparer différents mélanges administrés par perfusion (NP seule, NP avec ajoutextemporané d’insuline et NP avec insuline ajoutée 12 heures avant l’administration).Les paramètres de stabilité de l’émulsion de NP témoignent d’une stabilité du mélange nutritif.Une perte de 35% de la teneur en insuline est observée au cours de l’étude de 24 heures sur lemélange de NP ternaire supplémenté en vitamines et éléments-trace avec une diminutionmajoritairement au cours des 6 premières heures. Cette évolution est expliquée à 67% par leniveau de teneur en glucose du mélange, la nature de l’émulsion lipidique, l’absence d’élémentstraceainsi que le pH lorsque celui-ci est pris en considération avec la teneur en glucose, le tempset la teneur en acides aminés. La glycation de l’insuline, mise en évidence à l’aide de la méthodechromatographique, explique cette diminution de la teneur en insuline en présence d’un pHproche de la neutralité. Une réversibilité totale de la glycation de l’insuline est observée lors dela dilution des échantillons dans un milieu acide. Au cours de l’expérimentation in vivo, laconcentration maximale de l’insuline endogène de lapin est plus faible lorsque l’insulinehumaine est ajoutée extemporanément dans la NP, ce qui suggère que dans cette condition,l’insuline humaine possède une bioactivité supérieure. Ce résultat est en accord avec lesdonnées de la littérature sur l’insuline glyquée.En conclusion, l’ajout d’insuline dans un mélange de NP ternaire présente une stabilité physiquepermettant l’intégrité de l’émulsion. En revanche, l’étude de stabilité de l’insuline a révélél’existence d’un phénomène de glycation de l’insuline survenant principalement dans les 6premières heures de contact avec le mélange de NP. Cette insuline glyquée a montré une activitéhypoglycémiante réduite. Une étude approfondie du mécanisme de glycation ainsi qu’uncomplément de l’étude de stabilité du mélange de NP sont nécessaires.

Undernutrition is a public health problem that is the subject of a national policy whoseobjectives include prevention and treatment of this condition. Administration of parenteralnutrition (PN) involves metabolic complications, including hyperglycaemia as a major adverseeffect. Hyperglycemia increases the morbidity and mortality of patients receiving PN, either inhospital or at home. Therefore, insulin should be administered in conjunction with theadministration of PN. Addition of human insulin directly into PN bag is recommended only whenthe stability of the insulin on the one hand and the PN admixture on the other have beendemonstrated.The main objective of this work is to determine the stability of human insulin and the admixtureof ternary PN, mixed together.In order to achieve this objective, the following studies are being carried out : 1) evaluation ofthe physical stability of the ternary PN admixture 2) validation of an immunometric method forthe quantification of human insulin, in order to measure insulin over a 24-hour period afteraddition to an industrial ternary parenteral nutrition admixture supplemented with vitaminsand trace elements, then to study the impact of different factors (macronutritment composition,packaging, pH, etc.) on the evolution of the insulin concentration in this complex admixture 3)validation of a high performance liquid chromatography method with tandem massspectrometric detection to quantify insulin and detect glycated insulin in a mixture of binary PNduring 24-hour kinetics 4) study of the bioactivity of human insulin, using an animal testingprotocol to compare different admixtures administered by infusion (PN, PN withextemporaneous addition of human insulin and PN with insulin added 12 hours prior toadministration).Stability parameters of the PN emulsion show that the nutrient admixture is stable. A 35% lossin insulin content was observed during the 24-hour study on the ternary PN admixturesupplemented with vitamins and trace elements with a major decrease during the first 6 hours.This evolution is explained at 67% by the level of dextrose content of the admixture, the natureof the lipid emulsion, the absence of trace elements as well as the pH when taken intoconsideration with the dextrose content, the time and the amino acid content. The glycation ofinsulin, as demonstrated by the chromatographic method, explains this decrease in insulincontent in the presence of a pH close to neutrality. Total reversibility of insulin glycation isobserved when samples are diluted in an acidic medium. During the in vivo experiment, thehighest lagomorphic insulin concentration is lower when human insulin is addedextemporaneously to the PN, suggesting that in this condition, human insulin has a higherbioactivity, which is consistent with data in the literature on glycated insulin.In conclusion, addition of insulin to a ternary PN admixture has the physical stability to ensurethe integrity of the emulsion. On the other hand, the insulin stability study revealed theexistence of an insulin glycation phenomenon occurring mainly in the first 6 hours of contactwith the PN admixture. This glycated insulin showed reduced hypoglycemic activity. Furtherstudies are needed to precise glycation process and complete the chemical stability of the PNadmixture.