Expression cérébelleuse de TMEM240, mutée dans l’ataxie spinocérébelleuse de type 21

Cerebellar expression of TMEM240 protein, mutated in spinocerebellar ataxia type 21

• Auteur / Autrice : Mégane Homa
• Direction : Bernard Sablonnière
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 14/01/2020
• Etablissement(s) : Université de Lille (2018-2021)
• Ecole(s) doctorale(s) : École graduée Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Lille Neuroscience et Cognition (Lille) - Lille Neurosciences & Cognition - U 1172
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marie-Christine Chartier-Harlin, Vincent Huin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Giovanni Stevanin, Homa Adle-Biassette

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules de Purkinje

Cervelet

Ataxies spinocérébelleuses

Cervelet

Ataxie

Mots clés libres

TMEM240

SCA21

Cervelet

Cellule de Purkinje

TMEM240

SCA21

Cerebellum

Purkinje cell

Résumé

Les ataxies spinocérébelleuses (SCA) sont un groupe de maladies neurodégénératives hétérogènes tant sur le plan clinique que sur le plan génétique. Parmi ces SCA, l’ataxie spinocérébelleuse de type 21 (21) est caractérisée par un syndrome cérébelleux lentement progressif, mais se démarque des autres SCA par une apparition précoce des symptômes ainsi que des troubles cognitifs plus ou moins sévères. Une SCA21 est causée par des mutations dans le gène C1orf70, également appelée transmembrane protein 240 protéine transmembranaire 240 (TMEM240) codant la protéine du même nom. Le gène et la protéineTMEM240 n’ont été mis en évidence que très récemment et leurs fonctions sont encore inconnues à ce jour. De plus, aucune étude n’a montré l’expression physiologique de la protéine TMEM240 dans le cerveau.Le premier objectif de ce travail de thèse était d’effectuer une cartographie cérébrale de la protéine TMEM240 chez la souris. A cette fin, nous avons réalisé des immunofluorescences avec un anticorps commercial TMEM240 sur des coupes sagittales de cerveaux de souris. Le marquage obtenu a été quantifié dans l’ensemble des structures cérébrales visibles. Suite à cette analyse tissulaire, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l’expression cellulaire et subcellulaire de la protéine TMEM240 dans le cervelet puisque cette région est la principale région cérébrale est affectée dans la SCA21.L’expression de la protéine TMEM240 a donc été analysée plus finement dans les trois couches du cortex cérébelleux, les noyaux profonds cérébelleux ainsi que les différentes afférences cérébelleuses (fibres moussues, parallèles et grimpantes). Cette analyse a permis de mettre en évidence l’expression neuronale de la protéine TMEM240 dans plusieurs types cellules des couches du cortex cérébelleux, avec une localisation prédominante dans les cellules de Purkinje. De plus, nous avons pu également montrer l’expression de la protéineTMEM240 dans les trois noyaux profonds : les noyaux fastigial, interposé et dentelé. Des coimmunofluorescencesentre la protéine TMEM240 et des marqueurs des afférences cérébelleuses ont montré la présence de la protéine TMEM240 à la fois dans les fibres moussues, les fibres grimpantes mais également les fibres parallèles. De plus, nous avons également pu mettre en évidence l’expression synaptique de la protéine TMEM240 dans le cortex cérébelleux, à la fois par des techniques de co-immunofluorescence, des analysesbiochimiques de fractions enrichies en synaptosomes ainsi que par microscopie électronique.L’expression de TMEM240 a également été analysée sur coupes de cerveau humain.TMEM240 est localisée dans les mêmes neurones que dans le cerveau murin, avec uneexpression prédominante dans les cellules de Purkinje. De plus, des analyses de coimmunofluorescenceont également pu mettre en évidence l’expression synaptique de la protéine TMEM240 sur prélèvements humains de cervelets.Le second objectif de ce travail de thèse était de produire un nouvel anticorpsTMEM240 polyclonal afin de valider nos précédents résultats obtenus avec l’anticorps commercial mais également comme nouvel outil pour une caractérisation fonctionnelle decette protéine. Après avoir testé la spécificité de ce nouvel anticorps, dont l’épitope reconnait les acides aminés 63 à 77 de la protéine TMEM240, les mêmes analyses d’immunofluorescence que précédemment ont été effectuées. L’ensemble des résultats montrent des résultats similaires à l’anticorps commercial, avec une amélioration du signal.Ce nouvel anticorps sera donc un outil indispensable à la poursuite de nos études sur la protéine TMEM240 et la modélisation cellulaire et animale de la SCA21.Le troisième objectif de ce travail de thèse a été d’initier la modélisation cellulaire et animale de l’ataxie spinocérébelleuse de type 21. Cette maladie est caractérisée par une apparition précoce de symptômes chez certains patients [...]

Spinocerebellar ataxias (SCA) are a group of neurodegenerative diseases withheterogeneous clinical and genetic features. Among these SCA, spinocerebellar ataxia type 21(SCA21) is characterized by a slowly progressive cerebellar syndrome and differs from otherSCA by early onset symptoms and moderate to severe cognitive impairments. SCA21 iscaused by mutations in the C1orf70 gene, also called transmembrane protein 240 (TMEM240)which encodes a TMEM240 protein. TMEM240 gene and protein have been discoveredrecently and their functions are still unknown. Moreover, studies of physiological TMEM240protein’s expression in the brain are missing.The first aim of this study was to obtain a brain mapping of TMEM240 protein inmouse. We performed immunofluorescence studies with a TMEM240 commercial antibodyon sagittal brain sections of mice. The staining was quantified in all the brain structures. Afterthis tissue analyses, we focused on cellular and subcellular expression of TMEM240 proteinin the cerebellum since this region is the most affected in SCA21. TMEM240 proteinexpression was analyzed in the three layers of the cerebellar cortex, cerebellar deep nuclei andcerebellar afferents (mossy, parallel and climbing fibers). These analyses showed TMEM240neuronal expression in different types of neurons from the cerebellar cortex, with apredominant localization in Purkinje cells. We also showed TMEM240 protein expression inthe three cerebellar deep nuclei: fastigial, interposed and dentate nuclei. Coimmunofluorescencelabelling of TMEM240 protein and cerebellar afferents markers showedTMEM240 localization in mossy, climbing but also parallel fibers. Moreover, we also showedTMEM240 synaptic expression in the cerebellar cortex with co-immunofluorescence staining,biochemical analyses of synaptic fractions and electron microscopy. TMEM240 expressionwas also assessed on human cerebellar sections. TMEM240 is localized in the same neuronsas in mice brains, with a predominant expression in Purkinje cells. Co-staining analysesshowed TMEM240 synaptic expression in human cerebellum.The second aim of this study was to generate a new polyclonal antibody forTMEM240 to validate our previous results with the commercial antibody but also as a tool tofor functional investigations. After testing the specificity of this new antibody, we performedthe same analyzes as with the commercial antibody. Staining showed a similar pattern ofexpression than the commercial antibody, with an improvement of the staining since lessbackground staining is seen. Biochemical analyses of synaptosomes fractions showed similar results as with the commercial antibody. This new antibody can be used in histological andbiochemical experiments. This new polyclonal antibody will therefore be an indispensabletool for further studies onTMEM240 protein and in the cellular and animal modelization ofSCA21.The third aim of this study was to initiate cellular and animal models of SCA21.SCA21 is characterized by early onset symptoms. That’s why we hypothesized TMEM240involvement in the cerebellar neurodevelopment. Zebrafish model is widely used asneurodevelopmental disease model. We performed an in silico analysis to determine humanTMEM240 sequence homology with tmem240a (homology of 81%) and tmem240b(homology of 51%) from zebrafish. Gene expression of both genes was analyzed by RT-PCRat different early developments stages (between 1 hour and 5 day post fertilization) but also indifferent organs from adult zebrafish. Expression is localized in brain and eyes in adultzebrafish and is already present at 1 hour post-fertilization for Tmem240b and 1 day postfertilizationfor tmem240a. Both genes seem to be more expressed at 3 days post fertilization.In situ hybridization analyses show expression in brain, more specifically in hindbrain andcerebellum for both genes. These preliminary results open the way for an animal model ofSCA21.