Évaluation in vitro et in vivo de deux nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées dans l'adénocarcinome pancréatique : une immunothérapie ciblant l’Immune Checkpoint Galectine-9 et une thérapie photodynamique ciblant le récepteur folate

In vitro and in vivo evaluation of two new targeted therapeutic strategies in pancreatic adenocarcinoma : an immunotherapy targeting the Immune Checkpoint Galectin-9 and a photodynamic therapy targeting the folate receptor

• Auteur / Autrice : Alexandre Quilbé
• Direction : Nadirah Delhem
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 07/12/2020
• Etablissement(s) : Université de Lille (2018-2021)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Thérapies Laser Assistées par l'Image pour l'Oncologie - U 1189
• Jury : Président / Présidente : Delphine Allorge
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Delphine Allorge, Cindy Neuzillet, Pierre Van der Bruggen, Filoména Conti, Christophe Carnoy, Serge Mordon
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Cindy Neuzillet, Pierre Van der Bruggen

Mots clés

Mots clés contrôlés

antagonistes et inhibiteurs

Galectines

Exosomes

Lymphocytes T régulateurs

Photothérapie dynamique

Immunothérapie

Adénocarcinome

Dissertation universitaire

thérapie

Tumeurs du pancréas

Galectines

Exosomes

Lymphocytes T régulateurs

Immunothérapie anticancéreuse

Adénocarcinome

Photochimiothérapie

Immunothérapie

Cancer

Pancréas

Mots clés libres

Immunologie

Cancer

Immunothérapie

Immunology

Cancer

Immunotherapy

Résumé

Nous et d’autres équipes avons montré, qu’une augmentation de la prévalence des lymphocytes T régulateurs (Treg), favorisait la progression de la tumeur, en inhibant notamment la réponse immune anti-tumorale. Dans ce contexte, le laboratoire a développé une nouvelle stratégie d’immunothérapie active visant à inhiber spécifiquement l'activité suppressive des lymphocytes T régulateurs naturels humains (CD4+ CD25high FoxP3+ CD127-/Low). Celle-ci consiste en l’utilisation d’un anticorps (Ac) monoclonal (Brevet WO2015185875) ciblant la Galectine-9 (Gal-9) produite par les Treg et celle portée par les exosomes tumoraux. De façon très intéressante, il a été récemment montré dans un modèle murin de cancer pancréatique (ADKP), une augmentation significative de la Gal-9 intra-tumorale. Par ailleurs, une augmentation de la prévalence périphérique et intra-tumorale des Treg a également été décrite dans ce cancer. Ainsi, le cancer du pancréas parait être une cible privilégiée pour une immunothérapie ciblant la Galectine-9. Dans ce contexte, notre objectif a été d’évaluer in vitro et in vivo l’efficacité de notre Ac anti-Gal-9 dans différents modèles d’ADKP. Dans un premier temps, en collaboration avec le Dr Isabelle Van Seuningen (JPARC, Lille) nous avons évalué l’expression de la Gal-9 et la prévalence des Treg dès les stades les plus précoces de la carcinogenèse pancréatique dans un modèle murin transgénique et évaluer l’efficacité de notre Ac anti-Gal-9 sur ces lésions précoces. Nos données établissent que la neutralisation de la Gal-9 est parvenue à limiter l’infiltration en Treg et la progression des lésions néoplasiques dans ce modèle. Par ailleurs, afin d’anticiper l’utilisation d’une immunothérapie anti-Gal-9 chez l’homme, nous avons validé dans 4 lignées différentes de cancers pancréatiques humaines (Capan-1, Capan-2, MIAPaCa-2, PANC-1), l’expression génique (RT-QPCR) et protéique de la Gal-9 (IF, WB et cytométrie). Nous avons également montré que ces lignées étaient capables de sécréter la Gal-9 notamment via des exosmes (ELISA). Nos résultats suggèrent également que l’utilisation de l’Ac anti-Gal-9 permet de neutraliser les exosomes tumoraux d’ADKP et de limiter la croissance tumorale dans un modèle murin humanisé d’ADKPEn parallèle de ces travaux, nous avons initié un programme de recherche visant à évaluer une nouvelle stratégie dans l’ADKP : la Thérapie Photodynamique (PDT). Cette photothérapie basée sur l’utilisation d’un photosensibilisateur (PS) et d’une lumière de longueur d’onde spécifique, a déjà fait ses preuves en oncologie. De plus, il existe un rationnel pour penser que la PDT pourrait impacter la réponse immunitaire, en faveur d’une immunoactivation. Au laboratoire, nous disposons d’un nouveau PS (PS-FOL/PS2), protégé par un brevet récemment publié (WO2019 016397-A1). Ce PS2 est associé à une molécule d’acide folique ciblant le récepteur folate 1 (FOLR1) avec une forte affinité. Or, FOLR1 est exprimé dans 100% des ADKP, voire surexprimé dans 30 % des cas. Dans ce contexte, l’objectif du projet est d’évaluer l’efficacité de la PDT au PS2 sur 4 lignées humaines d’ADKP : Capan-1, Capan-2, MiaPaca-2 et Panc-1. Nous avons pu, ainsi, valider l’expression génique et protéique de FOLR1 sur ces 4 lignées, puis nous avons confirmé l’efficacité de la PDT couplée au PS2, sur ces lignées d’ADKP. Nos travaux montrent entre autres que les milieux conditionnés de ces cellules traitées par la PS2-PDT avaient un effet prolifératif sur le système immunitaire humain. Enfin, nous avons montré que la PS2-PDT semblait limiter la croissance tumorale dans un modèle in vivo de souris immunodéprimées (SCID) humanisées par transplantation sous-cutanée de cellules MIAPaCa-2.En conclusion, nos investigations suggèrent non seulement que la PS2-PDT est une thérapie ciblée efficace dans le traitement de l’ADKP mais aussi qu’elle permet d’activer le système immunitaire et de jouer le rôle d’une véritable vaccination adjuvante anti-cancéreuse.

Recently, other and our team have demonstrated that a high regulatory T lymphocytes (Treg) prevalence promotes tumor progression by inhibiting anti-tumor immune response. This was further substantiated by other studies on various cancer models. Using this knowledge, our laboratory has developed a new immunotherapy strategy targeting immunosuppressive activity of human natural Treg (CD4+ CD25high FoxP3+ CD127-/Low). This strategy targets Galectin-9 (Gal-9) produced and secreted by Treg cells using an anti Gal-9 monoclonal antibody (Patent WO2015185875). Thus, for the first time, we demonstrated that an anti-Gal-9 immunotherapy can significantly limit tumor growth in a humanized mouse model of nasopharyngeal carcinoma. In parallel, it have been shown a high Gal-9 expression in a mouse model of pancreatic cancer (PDAC), and a high prevalence of circulating and infiltrating Treg in PDAC patients. Thus, PDAC appears to be a privileged target for our anti-Gal-9 immunotherapy. In this context, our main objective was to evaluate the in vitro and in vivo efficacy of our anti-Gal-9 immunotherapy in PDAC. In close collaboration, with Dr. Isabelle Vanseuningen (JPARC, Lille), we were first able to evaluate the expression of Gal-9 and the prevalence of Treg from the earliest stages of pancreatic carcinogenesis in a transgenic mouse model. We have also evaluated the efficiency of anti-Gal9 treatment on tumor pancreatic progression. Our data demonstrated that the neutralization of Gal-9 was successful in limiting Treg infiltration along with neoplastic lesion progression. In a second time, in order to anticipate the use of this immunotherapy in humans, we also validated Gal-9 expression (RT-qPCR, Immunofluorescence, Western blot and cytometry) in 4 different human pancreatic cancer lines (Capan-1, Capan-2, MIAPaCa-2, PANC-1). Interestingly, we showed that these lines secrets Gal-9 in particular via exosomes (ELISA, Western-Blot). Finally, in vivo results suggested that our anti-Gal-9 antibody limits not only exosomes immunosuppressive impact, but also the tumor growth in a humanized mouse model of PDAC.Furthermore, we have initiated a novel study to evaluate a new therapeutic strategy for PDAC: The Photodynamic Therapy (PDT). PDT is based on the use of a non-toxic photosensitizer (PS) and a light excitation. Upon accumulation in the neoplasm and subsequent photo-excitation, the PS generates reactive oxygen species to elicit tumoral cytotoxicity. In the recent years, PDT has already proved its worth in the field of oncology. There is indeed a rationale to think that PDT could impact the immune response, in favor of immunoactivation against the tumor. In the laboratory, we have a new folate-coupled PS (PS2), protected by a recently published patent (WO2019 016397-A1, January 24, 2019), which binds with folate receptor 1 (FOLR1). FOLR1 is expressed in 100% of ADKPs, and even over-expressed in 30%. In this context, the objective was to evaluate the efficacy of PDT on 4 human PDAC lines: Capan-1, Capan-2, MiaPaca-2 and Panc-1. We validated the genomic and proteomic expression of FOLR1 on the 4 PDAC cell lines. Subsequently, we confirmed the efficacy of PS2 mediated PDT our 4 tumor cell lines. Our results also demonstrated that PDT affects the cytokine secretion of cancer cell lines and the conditioned media of these PS2-PDT-treated cells had a proliferative effect on the human immune system. Finally, we showed that PS2-PDT limits the tumor growth of our immunocompromised humanized mice (SCID) model with subcutaneously transplanted MIAPaCa-2 cells.In conclusion, our investigations suggest not only that PS2-PDT is an effective targeted therapy in the treatment of ADKP but also that it activates the immune system and plays the role of a real adjuvant anti-cancer vaccination.