Etude fonctionnelle des marqueurs pronostiques CD81 et ABCB1 dans les leucémies aiguës myéloïdes

Functional study of the prognostic markers CD81 and ABCB1 in acute myeloid leukaemia

• Auteur / Autrice : Fanny Gonzales
• Direction : Meyling Cheok
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 06/02/2020
• Etablissement(s) : Université de Lille (2018-2021)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Hétérogénéité, plasticité et résistance aux thérapies des cancers (CANTHER) - Cancer Heterogeneity, Plasticity and Resistance to Therapies - UMR 9020 - UMR 1277

Mots clés

Mots clés contrôlés

Résistance aux substances

Adhérence cellulaire

Pronostic

Leucémie aigüe myéloïde

Dissertation universitaire

Antigène CD81

Résistance aux médicaments

Cellules -- Adhésivité

Pronostic (médecine)

Leucémie aigüe myéloïde

Mots clés libres

Tétraspanine

Leucémie aiguë myéloïde

Pronostic

Adhésion

Chimiorésistance

Cellules souches leucémiques

Tetraspanin

Acute myeloid leukemia

Prognosis

Adhesion

Chemoresistance

Leukemic stem cell

Résumé

La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est une hémopathie hétérogène. La stratification thérapeutique repose sur les anomalies cytogénétiques et moléculaires. Les rechutes, probablement liées aux cellules souches leucémiques (CSL) sont dans la majorité des cas difficiles à prédire. Mon travail de thèse a consisté en l’étude de deux marqueurs de mauvais pronostic, liés aux CSL :1/ ABCB1, membre de la famille des transporteurs ATP Binding Cassette, connu pour son implication dans la chimiorésistance et2/ CD81, une tétraspanine, pour laquelle nous avons démontré l’impact pronostique dans les LAM. Méthodes1/ ABCB1 : nous avons évalué la relation entre l’activité d’ABCB1 et les caractéristiques cliniques, ainsi que la réponse aux chimiothérapies dans une cohorte de 321 patients atteints de LAM. Nous avons exploré l’association entre l’activité d’ABCB1 et la chimiorésistance ex vivo, l’expression génique et évalué l’effet d’un inhibiteur d’ABCB1.2/ CD81 : l’élaboration de lignées cellulaires ayant une expression différentielle de CD81, soit par surexpression de l’ADNc ; soit par sous-expression via des shARN nous a permis d’étudier la chimiorésistance, la prolifération, l’adhésion, la migration et l’invasion cellulaires. Par microscopie confocale, nous avons étudié la morphologie cellulaire.Des souris NSG ont été injectées avec ces modèles pour étudier la prise de greffe, le homing et l’invasion tumorale.D’autre part, nous avons xénogreffé des cellules de patients (PDX) pour étudier l’association entre l’expression de CD81 sur les blastes et la prise de greffe.Résultats1/ L’activité d’ABCB1, observée dans 58% des LAM était associée à une moindre leucocytose, une plus forte expression de CD34, une absence de mutations FLT3-ITD ou NPM1 et à une moindre survie globale et sans événement. Néanmoins, l’activité ABCB1 n’aboutissait pas directement à une chimiorésistance aux anthracyclines ex vivo. La corrélation entre l’expression d’ABCB1 et celle des gènes de BAALC, CD34, CD200 et CD7, suggère que l’expression d’ABCB1 pourrait être un indicateur indirect des LAM de haut risque. De plus, l’expression d’ABCB1 était inversement corrélée à celle des gènes de cluster HOX et à CD33.2/ Dans les PDX, la prise de greffe était associée à une plus forte expression de CD81 et le temps de prise de greffe était corrélé négativement au niveau d’expression de CD81.Les PDX avec les lignées modifiées avaient une invasion tumorale augmentée lorsque CD81 était surexprimé.Aussi, une forte expression de CD81 induisait in vitro une plus forte 1) adhésion à la fibronectine et aux fibroblastes, 2) migration et 3) invasion tumorale dans une matrice de gel semi-liquide.En microscopie confocale, les cellules exprimant plus le CD81 avaient plus de lamellipodes, impliqués dans la migration cellulaire. La chimiorésistance à la daunorubicine était corrélée positivement à l’expression de CD81.Conclusions1/ Nous avons démontré l’impact pronostique de l’expression génique, protéique et de l’activité d’ABCB1. De plus, ABCB1 ne serait pas directement impliqué dans la chimiorésistance, son inhibition n’améliorant pas la survie des patients mais plutôt un reflet indirect des formes de LAM de haut risque. Enfin, les patients avec faible expression d’ABCB1 pourraient bénéficier d’un traitement anti-CD33 par gemtuzumab ozogamicin associé à la chimiothérapie conventionnelle.2/ Une forte expression de CD81 est associée à un moins bon pronostic chez les patients atteints de LAM et dans notre modèle PDX. L’expression de CD81 sur les blastes au diagnostic est associée à une prise de greffe chez les souris NSG, suggérant qu’il pourrait être un marqueur souche. A présent, nous testons un anticorps anti-CD81 comme traitement dans un modèle murin. Une forte expression de CD81 augmente les capacités d’adhésion, de migration et d’invasion, médiées par la formation de lamellipodes et nous nous intéressons à l’implication des voies de signalisation Rac-RhoGTPase.

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous disease. Currently, therapeutic stratification relies on cytogenetics and molecular markers. In the majority of cases, relapses, probably due to leukemic stem cells (LSC), are challenging to predict.My thesis encompasses the clinical and functional study of two poor prognostic factors related to LSC:1/ ABCB1, a member of the ATP binding cassette transporter family, known for its implication in drug resistance, although the mechanism remains unclear and2/ CD81, a protein belonging to the tetraspanin family, for which we were the first to uncover its prognostic role in adult AML and for which the underlying mechanisms are presently unknown.Methods1/ For ABCB1, we evaluated its activity in relation to clinical parameters and treatment response to standard chemotherapy in 321 patients with AML. We assessed multiple clinical relationships of ABCB1 activity—ex vivo drug resistance, gene expression, and evaluated an ABCB1 inhibitor.2/ For CD81, we established AML cell lines with varying degrees of CD81 expression, either by cDNA over-expression or by shRNA mediated knock-down. On these models, we tested chemotherapy resistance, cellular proliferation, adhesion, migration and invasion. We performed confocal microscopy to study morphologic cell features.We injected NSG mice with different modified AML cells to study engraftment, homing and tumor invasion. We performed patient-derived-xenografts (PDX) to study the association between blasts CD81 expression and AML engraftment.Results1/ ABCB1 activity was observed in 58% of AML and was linked to low white blood cell count, high expression of CD34, absence of FLT3-ITD and absence of mutant NPM1. Moreover, ABCB1 activity was associated with worse overall- and event-free survival. However, ABCB1 activity did not directly lead to ex vivo drug resistance to anthracyclines. We found that ABCB1 expression was highly correlated with gene expressions of BAALC, CD34, CD200, and CD7, indicating that ABCB1 expression may be a passenger characteristic of high-risk AML. Furthermore, ABCB1 expression was inversely correlated to HOX cluster genes and CD33.2/ In PDX, engraftment rate was associated with higher CD81 expression and time-to engraftment was inversely correlated to the level of CD81 expression. The PDX with modified cell lines revealed increased tumor invasion in association with higher CD81 expression.Furthermore, we showed that high CD81 expression induced in vitro 1) adhesion to fibronectin and fibroblasts cells, 2) migration towards fibroblasts and 3) tumor invasion into a semisolid gel matrix. Using confocal microscopy, we observed that high CD81 cells form lamellipods implicated in cellular motility. We also established an association between CD81 expression and chemotherapy resistance, notably to daunorubicin.Conclusions1/ We showed prognostic importance of ABCB1 gene expression, protein expression, and activity. Furthermore, ABCB1 was not directly linked to drug resistance, as ABCB1 inhibition did not improve outcome of high ABCB1 AML patients. High ABCB1 may represent a passenger characteristic of high-risk AML. Finally, low ABCB1 AML patients could benefit specifically from anti-CD33 treatment by gemtuzumab ozogamicin in addition to standard chemotherapy.2/ High CD81 expression is linked to dismal prognosis in AML patients and in our PDX model. CD81 expression on blasts at diagnosis promotes engraftment in NSG mice; which may thus be a marker of stemness. Currently, we are testing CD81 antibody as a potential treatment using a murine xenograft model. Higher CD81 leads to enhanced capacity of adhesion, migration and invasion mediated by the formation of lamellipods and we are now investigating the implication of the Rac-RhoGTPases signaling pathways as an underlying mechanism.