Découverte et caractérisation des transporteurs de glycosides

Discovery and characterization of glycoside-transporters from uncultured bacteria

• Auteur / Autrice : Zhi Wang
• Direction : Gabrielle Potocki-Veronese, Elisabeth Laville
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénieries microbienne et enzymatique
• Date : Soutenance le 23/04/2020
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering - Toulouse Biotechnology Institute / TBI
• Jury : Président / Présidente : Matthieu Arlat
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Catherine Schouler, Roland Marmeisse, Nicolas Terrapon, Alexandra Tauzin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Catherine Schouler, Roland Marmeisse

Mots clés

Mots clés contrôlés

Prébiotiques

Microflore

Métagénomique

Oligosaccharides

Mots clés libres

Transporteurs d'oligosaccharides

Métagenomique

Microbiote

Prébiotiques

Relations structure-Fonction

Systèmes multi-Géniques

Oligosaccharide transporters

Metagenomics

Microbiota

Prebiotics

Structure-Function relationships

Multi-Genic systems

Résumé

La métabolisation des oligosaccharides et polysaccharides est une fonction capitale pour les bactéries, en particulier celles des microbiotes digestifs des mammifères. Pour s’en nourrir, elles ont développé une machinerie protéique très diversifiée pour reconnaitre, transporter et dégrader les sucres de structures complexes, notamment ceux composant les fibres alimentaires d’origine vétégale. Malgré le rôle crucial des transporteurs, leur identification et leur caractérisation restent limitées du fait de plusieurs verrous techniques, liés au fait que ces protéines membranaires sont difficiles à étudier sous forme recombinante, et que la majorité d’entre elles appartiennent à des bactéries non-cultivées. Dans le cadre de cette thèse, nous avons criblé une banque de clones fosmidiques d’Escherichia coli, contenant des loci métagenomiques impliqués dans la métabolisation d’oligo- et polysaccharides, pour des fonctions de transports. Treize clones métagénomiques issus des microbiomes digestifs humain et bovin ont été identifiés comme pouvant utiliser des oligosaccharides comme seules sources de carbone, grâce à la co-expression de gènes codant pour des enzymes actives sur les hydrates de carbone et pour des transporteurs de différentes familles. Nous avons ensuite développé une stratégie générique pour analyser, in vitro et in cellulo, la spécificité de transporteurs recombinants chez Escherichia coli, combinant ingénierie de loci et du génome de l’hôte, criblage et quantification de l’efficacité de liaison, de translocation et de croissance, à partir d’oligosaccharides non marqués. Grâce à ces développements technologiques, nous avons caractérisé deux loci identifiés après l'étape de criblage comme étant impliqués dans la métabolisation des fructooligosaccharides par des Clostridiales non cultivées, dont l'un constitue un biomarqueur du régime alimentaire et de pathologies. Nous avons décrypté le mécanisme de deux systèmes phosphotransférases (PTS) de compositions différentes, spécifiques du kestose, et avons mis en évidence la promiscuité des constituants des PTS des bactéries Gram-positives et négatives. De plus, l'intégration de données biochimiques et (méta)génomiques nous a permis de revisiter la classification et la distribution taxonomique des PTS bactériens, et de mieux comprendre l'interaction entre les prébiotiques et les bactéries intestinales. Enfin, la capacité de liaison d’une protéine de liaison aux glycanes, SusD, impliquée dans le transport de xylooligosaccharides par des bactéries du phylum Bacteroidetes, a été étudiée avec un large panel de techniques, et sa structure cristallographique résolue. L’ensemble de ces résultats démontre l'efficacité de notre stratégie pour identifier rapidement des transporteurs d’oligosaccharides de familles et d’origines taxonomiques variées, et pour caractériser les relations entre leur structure et leurs spécificités de liaison et de translocation.

Glycoside metabolization is a crucial function for bacteria, in particular those residing in the gut of mammals. To feed on the dietary fibers of plant origin, they have developed very diverse proteic machineries to recognize, transport and degrade glycosides of complex structures. Despite the crucial role of transporters, their identification and characterization remain limited due to the fact that these membrane proteins are difficult to study in recombinant form, and that the majority of them belong to uncultured bacteria. In this thesis work, we screened a library of Escherichia coli fosmid clones, containing metagenomic loci involved in the metabolization of oligo- and polysaccharides, for transport functions. Thirteen metagenomic clones issued from the human and the bovine gut microbiomes were identified as being able to utilize oligosaccharides as sole carbon sources, thanks to the co-expression of genes encoding carbohydrate active enzymes and transporters from different families. Then, we developed a generic strategy to analyze, in vitro and in cellulo, the specificity of recombinant transporters in Escherichia coli, combining carbohydrate utilization locus and host genome engineering, screening and quantification of the binding, translocation, and growth rates, based on the use of unlabeled glycosides. Thanks to these technological developments, we characterized two loci identified after the screening step to be involved in the metabolization of fructooligosaccharides by uncultured Clostridiales, of which one constitutes a dietary and pathology biomarker in the human gut microbiome. We deciphered the mechanism of two phosphotransferase systems (PTS) of different structures, that we proved to be specific for kestose, and highlighted the promiscuity of the PTS components of Gram-positive and negative bacteria. Furthermore, integration of biochemical and (meta)genomic data allowed us to revisit the classification and taxonomical distribution of bacterial PTS and to better understand the interaction between prebiotics and human gut bacteria. Finally, the binding ability of a surface glycan binding protein, SusD, involved in xylooligosaccharide uptake by Bacteroidetes, was investigated with a large panel of techniques, and its crystallographic structure solved. These results demonstrate the efficiency of our strategy to rapidly identify glycoside transporters from various families and taxonomical origins, and to characterize the relationships between their structure and their binding and translocation specificities.