Développement, validation et caractérisation d’un modèle ex vivo de peau humaine perfusé : FlowSkin

Development, validation and characterization of a perfused ex vivo human skin model : FlowSkin

• Auteur / Autrice : Emma Raude
• Direction : Laurent Malaquin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie, biologie, sante
• Date : Soutenance le 13/10/2020
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la Matière (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : LAAS - Laboratoire d'Analyse et d'Architecture des Systèmes - Laboratoire d'analyse et d'architecture des systèmes / LAAS
• Jury : Président / Présidente : Christophe Vieu
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Laurent Malaquin, Stéphanie Descroix, Bérengère Fromy, Nathalie Picollet-D'Hahan, Guy Serre
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Stéphanie Descroix, Bérengère Fromy

Mots clés

Mots clés contrôlés

Perfusion

Microfluidique

Mots clés libres

Microfluidique

Perfusion

Transport moléculaire

Modèle ex vivo

Peau humaine

Vascularisation

Vascularization

Mass transport

Human skin

Perfusion

Microfluidics

Ex vivo model

Résumé

Les modèles organotypiques tels que les explants de peau humaine sont les modèles les plus complexes et parmi les plus représentatifs de la peau in vivo existants à ce jour pour tester l’efficacité ou l’innocuité de molécules d’intérêts thérapeutiques au stade des études pré-cliniques. Cependant, l’absence de circulation sanguine et lymphatique dans ces modèles reste une limite importante dans l’homéostasie du tissu, notamment pour prédire les réponses de la peau à un traitement. De plus, les échanges en nutriments et en oxygène n’étant possibles que par diffusion, la durée de vie de ces modèles reste limitée. Différentes stratégies ont été mises en place afin de contrôler les mécanismes de transports moléculaires au sein de tissus biologiques. La microfluidique offre un fort potentiel pour contrôler la convection et la diffusion permettant l’échange de composés dans ces modèles de peau.L’objectif de ce projet est de développer, caractériser et valider un modèle de peau humaine ex vivo perfusé. Le but de cette perfusion intra-tissulaire est de favoriser les échanges de nutriments, d’oxygène ou de médicaments, mais également d’améliorer l’élimination des déchets métaboliques.Le premier objectif de mes travaux a consisté à mettre en place un flux intra-tissulaire dans un explant de peau humaine, et à développer un procédé permettant de maintenir l’explant perfusé en culture pendant plusieurs jours. Pour cela, un dispositif poreux a été implanté dans le derme du modèle ex vivo de peau humaine NativeSkin, développé par la société Genoskin, puis relié à un système microfluidique permettant l’infusion de composés au sein du tissu.Le deuxième objectif a consisté à développer des méthodes d’analyse de la diffusion de composés dans des explants de peau. Quatre méthodes ont été développées : l’évaluation macroscopique et qualitative de la diffusion à l’aide d’un colorant, l’étude de la diffusion en temps réel par radiographie à rayons X, l’étude de la diffusion en trois dimensions par tomographie à rayons X, et enfin l’analyse de la diffusion de dextrans fluorescents de différents poids moléculaires, sur coupes histologiques. Un modèle numérique permettant de simuler la diffusion dans le modèle de peau a également été développé sur le logiciel COMSOL, permettant de prédire le profil de diffusion d’un composé.Le troisième et dernier objectif a consisté à déterminer les paramètres de perfusion permettant une bonne diffusion des composés dans l’explant de peau, sans toutefois endommager le tissu. Une première série d’expériences (8 donneurs) a été réalisée sur des modèles perfusés à flux constant (2,5µL/min) avec du milieu de culture, pendant 10 jours. Les résultats ont montré qu’à l’issue de la culture, les modèles de peau ne présentent pas d’altération de la viabilité cellulaire ni de l’intégrité du tissu, avec un maintien de la prolifération et du métabolisme cellulaire. Cependant, la caractérisation de la diffusion dans le modèle a démontré un manque de reproductibilité dans les expériences, avec d’importantes variabilités inter et intra-donneurs. De plus, la perfusion de dextrans de différents poids moléculaires a démontré que la diffusion de composés de hauts poids moléculaires était limitée. Afin de pallier ces limites, nous avons proposé une nouvelle méthode de perfusion basée sur une modulation de la pression au sein du dispositif. L’application d’une légère surpression au sein du dispositif poreux permet d’améliorer la reproductibilité et l’efficacité des échanges moléculaires au sein de l’explant.Les résultats obtenus positionnent le modèle FlowSkin ainsi développé comme un nouvel outil pertinent pour évaluer l’efficacité ou la toxicité de molécules administrées par voie intraveineuse, directement sur de la peau humaine. De plus, la perfusion de transporteurs d’oxygène via ce système pourrait permettre de prolonger la durée de vie et donc d’améliorer encore la pertinence du modèle de peau ex vivo.

Organotypic models as human skin explants are the most complex and among the most representative of in vivo skin existing today to test the efficacy or the safety of molecules of therapeutic interest during preclinical studies. However, the loss of vascularization and lymphatic system in these models remains a major limitation in tissue homeostasis that impedes the prediction of skin responses to a treatment. In addition, exchanges of nutrients and oxygen being limited to diffusion, models lifetime is limited. Different strategies have been implemented to study and improve mass transport mechanism in such models. Microfluidics offers a great potential to control diffusion and convection mechanisms that permit molecular exchanges in skin models.The objective of this project is to develop, characterize and validate an ex vivo perfused human skin model. The purpose of this intra-tissue infusion is to promote the exchanges of nutrients, oxygen or drugs, but also to improve metabolic waste elimination.The first objective of my work consisted in implementing an intra-tissue flow in a human skin explant, and in setting up a process to maintain the perfused model in culture for several days. To this end, a porous device was implanted in the dermis of the ex vivo human skin model NativeSkin, developed by the company Genoskin. The implantable device is then connected to a microfluidic system allowing the infusion of compounds within the tissue.The second objective was to develop analysis methods of the diffusion of compounds in skin explants. Four methods have been developed: macroscopic and qualitative evaluation of the diffusion using a dye, the study of the diffusion in real time by X-ray radiography, the study of the diffusion in three dimensions by X-ray tomography, and finally the analysis of the diffusion of fluorescent dextrans of different molecular weights, on histological sections. A numerical model allowing to simulate the diffusion in the skin model has also been developed using COMSOL software, allowing to predict the diffusion profile of a compound.The third and last objective of my work was to determine perfusion parameters allowing efficient molecular exchanges of compounds in the skin explant, but without damaging the tissue. A first series of experiments (8 donors) was carried out on models perfused with a constant flow-rate (2.5 µL/min) with culture medium, for 10 days. The results showed that at the end of the culture, skin models did not show any alteration in cell viability or tissue integrity, with maintenance of cell proliferation and metabolism. However, diffusion characterization in the model demonstrated a lack of reproducibility in the experiments, with significant inter and intra-donor variability. In addition, the infusion of different molecular weights dextrans has demonstrated that the mass transport of high molecular weight compounds was limited through the implantable device. We demonstrated that the control of the fluid pressure is critical and that imposing a pulsatile injection with slight overpressures improves the efficiency and reproducibility of the molecular species delivery and collection in the explant.These results have shown the potential of the developed FlowSkin model as a new tool to study the efficacy or toxicity of intravenously administered drugs directly onto human skin. In addition, the combination of FlowSkin with perfusion of oxygen carriers offers unique opportunities to extend the lifetime and further improve the relevance of such ex vivo skin model.