Study of the factors regulating traction force production by cells
Etude des facteurs régulant la production de force de traction par les cellules
Résumé
Mechanical forces are involved in many physiological processes including morphogenesis, migration, division and differentiation. All these events involve a tight regulation of both the magnitude and spatial distribution of the contractile forces at the cell and tissue-level. Although we know that at the molecular level, the regulation of force production and transmission relies on the complex interplay between a well-conserved set of proteins of the cytoskeleton, we still do not have a comprehensive understanding of the mechanisms supporting force generation at the entire cell level. In addition, the magnitude of the traction forces exerted by cells on their underlying extracellular matrix in culture and as such the cell to cell variation of theses forces remain difficult to predict, largely because of the difficulty to characterize precisely how molecular components forming the actomyosin and adhesion networks, individually or via their specific interplay, are related to the force magnitude exerted by these cells. In this context, the aim of my PhD project was to investigate how key biological parameters are precisely related to force generation and regulation process.The first part of my study thereby focused on looking into the effect of the progression of the cell cycle on cell to cell heterogeneity in traction forces. I demonstrated that although the cell cycle status of the cells had a major impact on the magnitude of forces exerted by cells, it was not impacting the overall cell to cell variability in the traction force exerted. I also examined next the possibility that some internal/subcellular contractile efforts could be dissipated instead of being transmitted to cell anchorages by looking at the interplay between actin dynamics and traction forces. The analysis of actin turnover in stress fibers showed that although variations in strain energies were associated to variations in actin dynamics, they were not significant enough to explain the large cell to cell heterogeneities measured in traction force. Finally, I conducted a study dedicated to the characterization of the biochemical composition of the actomyosin network and adhesion pattern of cells in relationship with the force generated and transmitted by cells. To that end, I implemented the standard TFM assay in order to introduce an intermediate labeling step allowing for simultaneous measurement of traction forces and intracellular protein contents. This assay was then used to characterize the content of molecules of the actomyosin cytoskeleton and of the adhesions, either alone or in combination, and force. This work first demonstrated that the vinculin content measured at the level of the entire cell and the area of the focal adhesions, represented good predictors of force. I then showed that actin and myosin displayed broader deviations in their linear relationship to the strain energies, and thus appeared as less reliable predictors of force. Instead, my data suggested that their relative cellular amount plays a key role in setting the magnitude of force exerted by cells. I finally demonstrated that although the alpha-actinin content was not correlated at all with force magnitude, the relative amount of alpha-actinin as compared to actin content was of key importance to regulate force production.In conclusion, these results identified the biochemical contant of focal adhesion and the relative amounts of molecular motors and crosslinkers per actin as key parameters involved in setting the magnitude of force exerted by cells and thereby shed new light on the mechanisms supporting force generation at the entire cell level.
La production de forces mécaniques est impliquée dans de nombreux processus physiologiques incluant la morphogénèse, la migration, la division ou encore la différentiation. Tous ces évènements requièrent une régulation précise de la magnitude des forces et de leur distribution spatiale à l’échelle de la cellule et du tissu. Bien que la production de ces forces au niveau moléculaire repose sur l’interaction complexe d’un petit nombre de protéines bien identifiées, la régulation de ces forces aussi bien que leur mécanisme de transmission à l’échelle de la cellule entière demeure encore mal compris. D’autre part, prédire la magnitude des forces exercées par les cellules sur leur matrice extracellulaire ou leur variation s’avère impossible, en particulier à cause de la difficulté à caractériser précisément comment la composition des réseaux intracellulaires d’acto-myosine et celle des adhésions est reliée de manière individuelle ou combinée, à ces dernières. Dans ce contexte, l’objectif de ma thèse a été d’investiguer comment des paramètres biologiques clés sont impliqués précisément dans les processus de génération des forces et leur régulation.La première partie de mon étude s’est portée sur l’effet de la progression dans le cycle cellulaire sur l’hétérogénéité des forces développées par les cellules. J’y ai ainsi démontré que le statut des cellules dans le cycle cellulaire, bien qu’ayant un impact majeur sur la magnitude des forces exercées par les cellules, n’impactait pas la variation des forces intercellulaires. J’ai par la suite examiné la possibilité qu’une partie des efforts contractiles internes/sub-cellulaires soit dissipée au lieu d’être transmise aux ancrages cellulaires en étudiant l’interconnexion entre la dynamique de l’actine et les forces de traction. L’analyse du renouvellement dynamique de l’actine dans les fibres de stress a ainsi montré que bien que le turnover de l’actine variait en relation avec les modulations de forces, ces variations n’étaient pas suffisamment significatives pour expliquer l’hétérogénéité des forces mesurées entre les cellules. Pour finir, j’ai conduit une étude dédiée à la caractérisation de la composition biochimique du réseau d’actine et des adhésions en relation avec la force exercée et transmise par les cellules. Pour se faire, j’ai tout d’abord implémenté la technique classique de TFM en y incorporant une étape intermédiaire d’immunomarquage afin de pouvoir suivre simultanément les forces exercées par les cellules ainsi que leur composition biochimique. Cet essai a ensuite été appliqué à la caractérisation du lien entre le contenu intracellulaire de plusieurs protéines du cytosquelette d’actomyosine et des adhésions, seules ou combinées entre elles, avec la force. Ces travaux ont tout d’abord démontré que le contenu en vinculine, mesuré à l’échelle de la cellule entière, et l’aire des adhésions, constituaient de bons prédicteurs des forces cellulaires. J’ai par ailleurs pu montrer que l’actine et la myosine exhibaient quant à elles des déviations plus larges dans leur relation linéaire avec l’énergie mécanique des cellules, et représentaient ainsi des prédicteurs moins directs des forces. Au contraire, les données obtenues suggèrent que c’est leur composition relative dans la cellule qui détermine la magnitude des forces exercées par les cellules. J’ai enfin pu mettre en évidence que la quantité d’alpha-actinine cellulaire seule ne corrélait pas du tout avec les forces, mais que sa quantité relative par rapport à l’actine jouait un rôle clé pour réguler la production des forces.En conclusion, ces résultats ont permis d’identifier la composition biochimique des adhésions, ainsi que le contenu relatif des moteurs moléculaires et crosslinkers par rapport à l’actine comme des paramètres essentiels de la régulation de la production des forces.
Origine : Version validée par le jury (STAR)