Activité régulée d'une machinerie de transenveloppe bactérienne : le système de transport du LPS

Regulated activity of a bacterial transenvelope machinery : the LPS Transport System

• Auteur / Autrice : Tiago Baeta
• Direction : Jean-Pierre Simorre
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie biologie
• Date : Soutenance le 11/12/2020
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Cécile Morlot
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Pierre Simorre, Alessandra Polissi
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Carine Tisné, Sophie Zinn-Justin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Lipopolysaccharides

Infections à bactéries Gram négatives

Mots clés libres

Antibiotiques

Gram-Negative bacterie

Paroi cellulaire

Régulation

Machinerie de transport de LPS

Lps

Antibiotics

Gram-Negative bacteria

Cell wall

Regulation

Lpt transport machinery

Lipopolysaccharides

Résumé

Les bactéries présentent plusieurs mécanismes qui leur confèrent la capacité de faire face à des situations difficiles.Dans un contexte global de résistance aux antibiotiques, les bactéries à Gram négatif présentent des mécanismes de résistance intrinsèque. L'enveloppe multicouche complexe et dynamique, enrobée de lipopolysaccharides (LPS), confère à ces bactéries une capacité de survie accrue. La biosynthèse de ces glycolipides est initiée dans le cytoplasme et son transport se déroule depuis la membrane interne jusqu'à la membrane externe, avec une voie de biosynthèse/transport dédiée.La machinerie de transport des lipopolysaccharides (Lpt) comprend sept protéines fondamentales (LptA à LptG) qui couvrent toute l'enveloppe. Au niveau de la membrane interne, le transporteur LptB2FG couple l'hydrolyse de l'ATP avec l'extraction du LPS. LptB2 est directement en charge de l’hydrolyse de l’ATP tandis que LptF/G interagit avec le LPS et le transporte vers LptC/LptA dans le périplasme.Cette machinerie utilise une architecture conservée avec des domaines de jellyroll dédiés présents sur LptF/G/C/A qui s'assemblent en un pont permettant au LPS de s'écouler vers la membrane externe.Les molécules qui seraient capables de perturber les interactions entre protéines et les différents domaines jellyroll du système, pourraient devenir de puissants inhibiteurs de la construction de la paroi cellulaire. La thanatine, un peptide antimicrobien naturel, a été décrite comme ciblant les domaines jellyroll de la machinerie. Nous avons examiné son effet dans la perturbation du complexe LptC/A. La thanatine se lie pas à LptC mais uniquement à LptA et inhibe l'assemblage du complexe à faible concentration (de l’ordre du nao molaire), démontrant ainsi le potentiel des interactions entre les jellyrolls du système LptC.Le réseau d'interactions entre LptB2FG et LptC/A n'est pas entièrement compris. Le LptB2FG a été produit dans des micelles de détergents et dans des particules de type nanodisque, pour sonder les interactions avec LptC et LptA à l'échelle atomique, à l'aide de diverses techniques biophysiques.Dans l'assemblage du pont LptB2FGCA, LptC/F interagissent principalement à travers les domaines jellyroll. Une mutation dans le résidu R212 de LptF a rendu la présence de la protéine LptC facultative in vivo.La caractérisation biophysique/biochimique a montré une interaction inchangée du mutant LptB2FG avec LptC et LptA, tandis que l'activité ATPase a montré un manque de régulation par la présence de ses partenaires. Cela nous a conduit à proposer que R212 soit un point de contrôle dans LptF pour que LptB2FG détecte le bon assemblage de la machinerie.Lorsque le complexe LptB2FGCA est assemblé in vitro, LptB2 s'est avérée capable de catalyser le phosphotransfert entre deux molécules d'ADP, générant de l'ATP et de l'AMP, et représentant une nouvelle activité (Adenylate Kinase) jusqu'alors non décrite pour cette protéine. Étant un sujet très récent dans la littérature, le rôle des transporteurs à double fonction n'est pas encore bien compris. Pour caractériser l'équilibre entre ATPase et Adenylate Kinase, nous avons muté LptB2 sur des motifs ABC clés pour sonder l'emplacement de l'activité Adenylate Kinase. L’étude du complexe LptB2FG préparé dans des particules de nanodisques, suggère que l'équilibre entre les activités dépend de l'assemblage dynamique de LptB2FGCA. La caractérisation structurale de LptB2 dans sa forme apo et lié aux nucléotides a été initiée.Ce projet, axé sur le système Lpt essentiel pour la survie bactérienne, met en lumière l'importance des interactions protéine-protéine comme cibles pour la conception de futurs composés antimicrobiens. L’intérêt de cibler des transporteurs à double fonction, à la fois impliqués dans la synthèse de la paroi cellulaire et l'exportation de médicaments, pourrait aussi représenter une piste prometteuse pour la recherche future de nouvelles drogues.

Bacteria display several intrinsic mechanisms which confers them the ability to cope with disadvantageous situations, such as nutrient deprivation, environmental inter/intra-species competition, managing adaptation to detrimental conditions, and handling effects of antibacterial compounds.In a global context of antibiotic resistance accelerated by anthropogenic activities, gram negative bacteria display intrinsic resistance mechanisms. The complex and dynamic multilayered envelope, coated with lipopolysaccharides (LPS), confers these bacteria increased survivability. Biosynthesis of these complex glycolipids is initiated in the cytoplasm, and its transport proceeds along the inner membrane, periplasm, until reaching the outer membrane, with a dedicated biosynthetic pathway and transport machinery.The Lipopolysaccharide Transport (Lpt) machinery comprises 7 fundamental proteins (LptA to LptG) that span the entire envelope. More specifically, at the inner membrane, LptB2FG ABC transporter couples ATP hydrolysis with LPS extraction. LptB2 cycles ATP while LptF/G interact with LPS and carry it towards LptC and LptA in the periplasm.This machinery uses a conserved architecture with dedicated jellyroll domains present on LptF, LptG, LptC and LptA that assemble into a bridge that allow LPS flow to the outer membrane.Molecules that would disrupt protein-protein interactions between the different jellyroll domains of the Lpt system could become potent cell wall inhibitors. Thanatin, a natural occurring antimicrobial peptide, has been described as targeting the jellyroll domains of the machinery. We screened its effect in the disruption of LptC-LptA complex. Thanatin binds to LptA but not LptC and inhibits the assembly of the complex at low nM concentrations, showing the potential of targeting Lpt Jellyroll-jellyroll interactions.The network of interactions between the Inner membrane complex, LptB2FG and periplasmic LptC and LptA is not fully understood. LptB2FG was produced in detergent micelles and within nanodisc particles, to probe interactions with LptC and LptA at an atomic scale, using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and biophysical techniques.In the assembly of the LptB2FGCA bridge, LptC and LptF interact mostly through the jellyroll domains. A mutation in the LptF jellyroll (R212 residue) rendered LptC presence facultative in vivo.Biophysical and biochemical characterization showed unaltered interaction of mutant LptB2FG with LptC and LptA, whereas ATPase activity showed lack of regulation by presence of its partners. This led us to propose that R212 is a checkpoint in the LptF jellyroll, acting as a hub for LptB2FG to sense proper assembly of the machinery.When LptB2FGCA complex is assembled in vitro, LptB2 was found capable of catalyzing phosphotransfer between ADP molecules, generating ATP and AMP, a novel activity (Adenylate Kinase) previously undescribed for this protein. Being a topic of very recent interest in the literature, the role of dual-function transporters is not understood. To characterize the balance between ATPase and AK, we mutated LptB2 on key ABC motifs to probe possible location for AK activity. LptB2FG studied in nanodisc particles, suggests that balance between activities depends on the dynamic assembly of LptB2FGCA, with regulatory mechanisms possibly not being shared between both activities. Structural characterization of LptB2 in apo and nucleotide bound-state was initiated .This project, focused on the essential Lpt system, sheds light on the importance of protein-protein interactions as targets for designing future antimicrobial compounds. It could also be worth evaluating if dual-function transporters, involved in cell wall synthesis and drug export, are valid targets for future drug screenings.