Identification d'une nouvelle protéine eucaryote essentielle pour la localisation membranaire de la toxine ExoU de Pseudomonas aeruginosa

Identification of a new eukaryotic protein essential for the membrane localization of ExoU toxin from Pseudomonas aeruginosa

• Auteur / Autrice : Vincent Deruelle
• Direction : Philippe Huber
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 10/11/2020
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie du cancer et de l'infection (Grenoble ; 2010-2020)
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Tardieux
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Philippe Huber, Étienne Meunier, Thomas Henry
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Matteo Bonazzi, Laurent Dortet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Virulence (microbiologie)

CRISPR-Cas9

Infections à Pseudomonas aeruginosa

Mots clés libres

P. aeruginosa

Infection

CRISPR-Cas9

ExoU

Dnajc5

Résumé

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram-négative opportuniste, responsable de différents types d'infections, et notamment de maladies nosocomiales. Les infections aiguës causées par ce pathogène sont dues à un large panel de facteurs de virulence, dont le plus agressif est un système de sécrétion de type III. Parmi les quatre effecteurs injectés par ce système dans le cytoplasme des cellules cibles, ExoU est le plus cytotoxique. Les souches ExoU+ sont associées aux pathologies les plus sévères et à une multirésistance aux antibiotiques plus élevée. La toxine possède une activité phospholipase qui induit une nécrose cellulaire après rupture de la membrane plasmique. Cependant, le trafic de la toxine dans les cellules hôtes pour atteindre la membrane plasmique n’est pas connu.Dans ce travail, j’ai recherché des partenaires eucaryotes d’ExoU en réalisant un criblage génétique sur l’ensemble du génome humain, mettant en oeuvre le système CRISPR-Cas9. J’ai ainsi identifié le gène codant pour une protéine co-chaperone appelée DNAJC5. Cette protéine, localisée à la surface des endosomes tardifs, est impliquée dans un système de sécrétion non-conventionnel permettant le relargage de protéines cytosoliques mal repliées. Nous démontrons dans des modèles cellulaires et chez la drosophile, que l'absence de DNAJC5 confère une résistance à la nécrose induite par des souches ExoU+. Dans le cytoplasme, la toxine est localisée à la membrane des vésicules DNAJC5+. Des mutations dans le gène DNAJC5, empêchant le trafic des endosomes tardifs DNAJC5+ vers la membrane plasmique, entravent également la localisation d’ExoU à ce niveau et inhibent sa cytotoxicité. Nous concluons, qu'une fois administrée dans le cytoplasme de la cellule hôte, ExoU utilise des vésicules DNAJC5+, pour être transportée à la membrane plasmique, un processus strictement nécessaire à la nécrose cellulaire induite par la toxine.

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic Gram-negative bacterium, responsible for different types of infection, in particular for nosocomial diseases. The acute infections caused by this pathogen are promoted by a broad panel of virulence factors; the most aggressive one being the Type III Secretion System. Among the four effectors injected by this system into the cytoplasm of target cells, ExoU is the most cytotoxic one. ExoU+ strains are associated with the most severe pathologies and to higher multiresistance to antibiotics. The toxin possesses a phospholipase activity inducing cell necrosis upon plasma membrane rupture. However, the trafficking of the toxin in host cells to reach the plasma membrane is unknown.In this study, I aimed at identifying ExoU host partners, using a genome-wide screen employing the CRISPR-Cas9 system. Likewise, I identified the gene encoding a co-chaperone protein, named DNAJC5. This protein, located at the surface of late endosomes, is involved in an unconventional secretion pathway required for the release of misfolded cytosolic proteins. Using human cellular models, as well as Drosophila, we demonstrate that lack of DNAJC5 confers resistance to ExoU+ strain infection. In the host cytoplasm, the toxin localizes at the surface of DNAJC5+ vesicles. Mutations in DNAJC5 gene, preventing vesicle trafficking to the plasma membrane, also impede ExoU targeting to the plasma membrane and inhibit its cytotoxicity. We conclude that, once delivered into the host cell cytoplasm, ExoU uses DNAJC5+ vesicles to be transported to the plasma membrane, a process strictly required for ExoU-induced cell necrosis.