Rôle de l'interférence à ARN (RNAi) dans l'intégrité du génome chez la levure S. pombe

Role of interference RNA (RNAi) in DNA integrity in the yeast S. pombe

• Auteur / Autrice : Nina Farida Abderahmane
• Direction : André Verdel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 25/06/2020
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut pour l'avancée des biosciences (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Gilles Faury
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : André Verdel, Jérôme Poli, Sarah Lambert, Hervé Menoni
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Pei-Yun Jenny Wu, Hervé Seitz

Mots clés

Mots clés contrôlés

ADN -- Réparation

ADN -- Réplication

ARN interférence

Mots clés libres

Interférence à ARN

Instabilité génomique

Réplication de l'ADN

Réparation de l'ADN

ADN ribosomaux

Levure

Stress réplicatif

RNA Interference

Genomic instability

DNA replication

DNA repair

Ribosomal DNA

Yeast

Replication stress

Résumé

Préserver l’intégrité du matériel génétique est crucial pour assurer la survie cellulaire et prévenir le développement tumoral. L’ARN à interférence (RNAi) joue un rôle important dans ce contexte. Il s’agit d’un processus conservé surtout connu pour sa fonction de silencing transcriptionnel visant à induire la formation d’hétérochromatine chez différentes espèces. Au vu des divers rôles protecteurs dans l’intégrité du génome que revêt cet état chromatinien, le RNAi concourt ainsi, par ce biais, à préserver la stabilité du génome. Le RNAi a également été impliqué plus directement dans la réponse au stress génotoxique chez une variété d’eucaryotes. Dans ce cas, il agirait dans la signalisation ou la réparation des dommages de l’ADN. Cependant, cette fonction et les mécanismes moléculaires, qui sous-tendent son implication, restent très peu caractérisés, bien que la fonction soit clairement conservée de la levure à l’Homme.Dans cette étude, nous avons exploré la fonction moléculaire du RNAi dans le maintien de la stabilité génomique, en utilisant la levure Schizosacharomyces pombe comme modèle d’étude. Dans cet organisme, la fonction clé du RNAi dans la formation d’hétérochromatine a été disséquée. Son mécanisme d’action se base sur le complexe effecteur RITS (RNA Induced-Transcriptional Silencing), qui se charge en petits ARN produits par Dcr1. Ces derniers permettent de guider RITS au niveau des régions cibles afin de recruter les facteurs assurant la déposition et la maintenance des marques épigénétiques répressives associées à la formation d’hétérochromatine. En parallele, le RNAi participerait également à la résolution des collisions entre les machineries de réplication et de transcription se produisant au niveau de régions difficiles à répliquer, comme les régions riches en séquences d’ADN répétées. Selon le modèle proposé, il favoriserait la terminaison de la transcription, ce qui permettrait à la fourche de réplication de poursuivre sa progression (Zaratiegui et al., Nature, 2011 ; Castel et al., Cell, 2014).Notre étude a d’abord montré que RITS, et pas seulement Dcr1, sont impliqués dans le maintien de la stabilité génomique chez S. pombe. La combinaison d’approches biochimiques et d’analyses microscopiques a révélé des connexions physiques entre RITS et les processus de réplication et de réparation de l’ADN. Nous nous sommes particulièrement intéressés à la fonction du RNAi dans la stabilité des rDNA. Nos données ont indiqué que le RNAi participe au maintien des nombreuses unités de rDNA, prévenant ainsi des réarrangements chromosomiques majeurs. Cette fonction requière RITS et Dcr1, mais n’implique pas d’autres facteurs essentiels à la formation d’hétérochromatine RNAi-dépendante. D’autre part, nous avons mis en évidence que le RNAi contribue à favoriser la progression des fourches de réplication au niveau d’une région proche des origines de réplication de l’unité ribosomale. Les fourches arrêtées constituent des structures fragiles pouvant entraîner une instabilité génomique. Afin d’explorer plus en détail la fonction du RNAi dans leur prise en charge, nous avons utilisé un système permettant de bloquer localement et de façon inductible la progression d’une seule fourche de réplication dans le génome. L’essai génétique basé sur ce système suggère que RITS et Dcr1 favoriseraient le redémarrage via la recombinaison homologue au niveau de la fourche bloquée. Ils agiraient tout particulièrement sur l’étape de la résection initiant ce processus. Dans l’ensemble, ces travaux permettent une meilleure compréhension de la fonction moléculaire du RNAi dans la réponse cellulaire au stress réplicatif. Cet aspect a été assez peu exploré dans les études actuelles chez les autres espèces eucaryotes.

Preserving the integrity of genetic material is crucial to ensure cell survival and prevent tumor development. RNA Interference (RNAi) plays an important role in this context. This conserved process is well known to mediate sequence-specific transcriptional gene silencing via the induction of heterochromatin formation in a large variety of species. Through the various protective roles that this chromatin state has on the genome integrity, RNAi contributes to the preservation genomic stability. In parallel, RNAi has been involved also more directly in the cell response to genomic DNA damage in a variety of eukaryotes. In this case, it would participate to DNA damage signalization or repair. However, this function and the molecular mechanisms underlying its involvement remain poorly characterized, eventhough the function appears to be conserved from yeast to human.In this study, we explored the molecular function of RNAi in maintaining genomic stability, using the yeast Schizosacharomyces pombe as a model. In this organism, the key function of RNAi in the formation of heterochromatin has been extensively studied. The mechanism of action relies on the effector RITS complex (RNA Induced-Transcriptional Silencing), which is loaded with Dcr1produced small RNAs. These small RNAs guide RITS to the target regions in order to recruit the factors ensuring the deposition and maintenance of repressive epigenetic marks associated witth the formation of heterochromatin. RNAi has also been involved in the resolution of collisions between the replication and transcription machineries, occurring at hard-to-replicate genomic regions, like at regions containing highly repeated DNA. According to the current model, RNAi favors transcription termination thereby favouring replication fork progression (Zaratiegui et al., Nature, 2011 ; Castel et al., Cell, 2014).Our study first showed that RITS, and not just Dcr1, are involved in maintaining genomic stability in S. pombe. The combination of biochemical and microscopic approaches revealed physical connections between RITS and the DNA replication and repair processes. We studied in particular the implication of RNAi in the genomic stability of the rDNA region. Our data indicated that RNAi participates in the maintenance of the numerous rDNA units, thereby preventing major chromosomal rearrangements. This function requires RITS and Dcr1, but does not involve other factors essential for the formation of heterochromatin. Moreover, we identified that RNAi contributes to promote replication fork progression within a region close to the origin of replication of the ribosomal unit. The terminally-arrested replication forks constitute fragile structures which can cause genomic instability. In order to further explore this function of RNAi, we used a conditional and inducible fork barrier to block replication at a unique locus in the genome. A genetic assay based on this system, strongly suggest that RITS and Dcr1 manages the homologous recombination-dependent fork restart by acting specifically on the DNA resection step of this process. Altogether, our findings provide a better understanding of the RNAi molecular function in the cellular response to replicative stress. This aspect has been poorly explored by the current studies led in other eukaryotic models.