Rôle du complexe Ro60/RNYs dans les macrophages chargés des lipides

Role of Ro60/RNYs complex in lipid-laden macrophages

• Auteur / Autrice : Sofia Fazio
• Direction : Michele Trabucchi, Jean-François Tanti
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 11/12/2020
• Etablissement(s) : Université Côte d'Azur
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Côte d’Azur (2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre Méditerranéen de Médecine Moléculaire (Nice)
• Jury : Président / Présidente : Giulia Chinetti-Gbaguidi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Giulia Chinetti-Gbaguidi, Stefania Millevoi, Francesco Nicassio, Stephan Vagner
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Stefania Millevoi, Francesco Nicassio

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transcription génétique

Inflammation

Macrophages

Mots clés libres

Ro60

RNY

Macrophages

Inflammation

Régulation transcriptionnelle

Ro60

RNY

Macrophages

Inflammation

Transcriptional regulation

Résumé

Ro60, protéine de liaison à l'ARN qui s'associe aux YRNAs pour former le complexe RoRNP, est une cible de la réponse immunitaire chez les patients atteints de lupus érythémateux disséminé (LED) et du syndrome de Sjögren (SS). Les autoanticorps anti-Ro60 dans le patients SLE et SS peuvent pénétrer à l'intérieur des cellules et se localiser dans le noyau. Les souris Ro60-/- développent un syndrome auto-immun et un statut pro-inflammatoire avec des caractéristiques de LED, indiquant l’implication de Ro60 dans la pathogenèse de cette maladie. D’autre part, les patients atteints de LED et de SS meurent principalement de troubles cardiovasculaires inflammatoires causés par une athérosclérose accélérée. Sur la base de ces observations, nous avons émis l'hypothèse que l'inflammation et les accidents cardiovasculaires chez les patients SLE/SS seraient causés par le dysfonctionnement du complexe Ro60 dans le noyau. Pendant ma thèse, nous avons montré que dans les macrophages chargés de lipides et dans les cellules THP-1 stimulées par des stimuli pro-inflammatoires, la dégradation des YRNAs permettrait à Ro60 de se lier à la chromatine, d’une façon indépendante de l'ARN. Par analyse des données de ChIP-seq, nous avons caractérisé la distribution des sites de liaison Ro60 sur la chromatine et trouvé une augmentation significative de la liaison de Ro60 lors du traitement à l'acide palmitique (PA) sur des promoteurs de gènes codants, indiquant que Ro60 pourrait être directement impliqué dans leur transcription. Ensuite, nous avons effectué une analyse Exon-Intron Split (EISA), approche bioinformatique permettant de quantifier les régulations transcriptionnelles et post-transcriptionnelles à partir de données d’ARN-seq de différentes conditions expérimentales grâce à des expériences en cinétique. L'analyse EISA a été appliquée aux données d’ARN-seq obtenues à partir de cellules THP1 traitées ou non par le PA et en présence ou en absence de Ro60, en réduisant l'analyse sur les gènes ciblés par Ro60 et trouvés par ChIP-seq. Nos résultats indiquent qu’après 6h de traitement avec du PA, Ro60 favorise significativement la transcription de 247 gènes cibles qui régulent la réponse inflammatoire. Nous avons validé le contrôle direct sur trois gènes cibles (TRIM62, ZEB1 et CPT1A) en utilisant des cellules THP1 où l’expression de la protéine Ro60 a été réduite ou non de manière stable. Enfin, pour identifier les partenaires moléculaires qui contribueraient à cette nouvelle fonction de Ro60, nous avons réalisé une analyse LC/MS/MS quantitative label-free à partir des complexes immunoprécipités contenant Ro60 dans des cellules THP-1 non traitées ou pas. Nous avons constaté que Ro60 interagit avec les composants des complexes TREX (TRanscription et EXport) et nucléopores (THOC1, THOC4 et TPR). THOC4 interagit directement avec Ro60. Ces résultats ont soulevé la possibilité que Ro60 régulerait la transcription et l'exportation des produits de transcription impliqués dans la réponse inflammatoire dans les macrophages grâce à son association avec le TREX. Nous avons donc effectué l'analyse EISA dans les cellules THP-1 traitées ou pas par le PA, en présence ou en absence de THOC4, et avons constaté que la synthèse de 25 transcrits, y compris TRIM62, ZEB1 et CPT1A, était régulée à la baisse en absence de THOC4 et de Ro60. En conclusion, nous avons caractérisé une nouvelle fonction associée à la chromatine de Ro60, qui se lie à THOC4 pour réguler le programme d'expression génique des macrophages chargés de lipides. L'altération de ce nouveau mécanisme chez les patients LED/SS pourrait favoriser l'état inflammatoire global et le risque plus élevé de rencontrer des accidents cardiovasculaires. En plus de fournir de nouvelles informations sur la régulation de l'expression génétique, l'impact plus large de ce projet réside dans l'opportunité de fournir de nouvelles données étiologiques pour les patients atteints de LED et de SS.

Ro60, an RNA-binding protein that associates with YRNAs, is a clinical target of the immune response in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and Sjogren’s syndrome (SS). SLE and SS autoantibodies, including the anti-Ro60 autoantibody, penetrate inside the cells and localize in the nucleus. Interestingly, mice lacking Ro60 develop an autoimmune syndrome and pro-inflammatory status with features of SLE, indicating that Ro60 loss-of-function is involved in SLE pathogenesis. SLE and SS patients mainly die of premature inflammatory cardiovascular disorders caused by accelerated atherosclerosis. Based on these observations, we hypothesized that inflammation and cardiovascular accidents in SLE/SS patients would be caused by the dysfunction of Ro60 complex in the nucleus. During my PhD, we showed that in human and mouse primary macrophages and THP-1 cells (human monocytic cell line) stimulated with pro-inflammatory and pro-atherogenic stimuli (lipidladen macrophages), YRNA degradation allows Ro60 to bind chromatin in an RNA-independent fashion. To identify Ro60 binding sites on chromatin, we performed ChIP-seq analysis and found a significant increase of Ro60 binding upon palmitic acid (PA) treatment on promoters of coding genes, indicating that Ro60 could be involved in their transcription. By de novo motif discovery, we found two binding motifs that were significantly enriched in Ro60-binding sites. Next, to study the function of chromatin-associated Ro60 on its target genes, we performed RNA-seq in time course experiments on PA-treated and untreated THP1 cells, in presence or absence of Ro60. After, on the RNA-seq data obtained, we performed Exon-Intron Split analysis (EISA), a bioinformatic approach to quantify transcriptional and post-transcriptional regulation of gene expression from RNA-seq data of time course experiments. Our results indicate that Ro60 significantly promotes the transcription of 247 target genes that regulate inflammatory response upon 6h of PA treatment. We validated the direct control on three target genes (TRIM62, ZEB1 and CPT1A) by using a stably viral infected sh-Ro60-THP1 cells and control. On the other hand, by GO-term analysis performed on the RNA-seq data, we found that Ro60 knockdown overall promotes a pro-inflammatory phenotype in PA-treated Mo. Lastly, to identify Ro60 molecular partners that would contribute to this chromatin-associated function in lipid-laden macrophages, we performed a label-free quantitative LC/MS/MS analysis from the immunoprecipitated Ro60-containing complex in PA-treated and untreated THP-1 cells. We found that Ro60 interacts with components of the TREX (TRanscription and EXport) and nucleopore complexes, including THOC1, THOC4 and TPR. By performing co-IP experiments, we showed that THOC4 directly interacts with Ro60 on the chromatin and full cell extract. These results raised the possibility that Ro60 would directly regulate the transcription and export of transcripts involved in the inflammatory response in lipid-laden macrophages through its association with the TREX complex. We thus performed the EISA analysis in PA-treated and untreated THP-1 cells upon THOC4 knockdown and control and found that the synthesis of 25 transcripts, including TRIM62, ZEB1, and CPT1A, was downregulated in both THOC4 and Ro60 knockdown. In conclusion, we characterized a novel chromatin-associated function of Ro60, which associates with THOC4 to regulate the gene expression program of lipid-laden macrophages. The impairment of this new Ro60-dependent mechanism in SLE/SS patients by the nuclear penetration of anti-Ro60 autoantibodies in Mo/Ma could promote the overall inflammatory status of these patients and the higher cardiovascular accidents risk. In addition to provide new insights into regulated gene expression programs, the broader impact of this project resides in an opportunity to provide new etiological inputs for SLE and SS patients.