Les systèmes Toxine-Antitoxine VapBC : des régulateurs de la symbiose fixatrice d'azote Rhizobium-Légumineuse

The VapBC Toxin-Antitoxin systems : regulators of the nitrogen-fixing symbiosis Rhizobium-Legume

• Auteur / Autrice : Camille Syska
• Direction : Geneviève Alloing, Laurence Dupont
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 18/11/2020
• Etablissement(s) : Université Côte d'Azur
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Côte d’Azur (2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Sophia Agrobiotech (Sophia Antipolis, Alpes-Maritimes)
• Jury : Président / Présidente : Marc Lepetit
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marc Lepetit, Emanuele Biondi, Patricia Bordes, Sophie Helaine
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Emanuele Biondi, Patricia Bordes

Mots clés

Mots clés contrôlés

Symbiose

Sinorhizobium meliloti

Systèmes toxines-antitoxines

Mots clés libres

Toxine-Antitoxine

VapBC

Sinorhizobium meliloti

TRNase

Symbiose

Medicago truncatula

Toxin-Antitoxin

VapBC

Sinorhizobium meliloti

TRNase

Symbiosis

Medicago truncatula

Résumé

Lors de la symbiose fixatrice d’azote entre la légumineuse modèle Medicago truncatula et la rhizobiacée Sinorhizobium meliloti, les bactéries, différenciées en bactéroïdes dans la nodosité, réduisent l’azote atmosphérique (N2) en ammoniac (NH3), directement assimilable par la plante. En contrepartie, la plante fournit à son symbiote une niche écologique et des substrats carbonés. Tout au long de l’interaction, la bactérie est confrontée à des microenvironnements changeants depuis la vie libre dans le sol, l’infection et l’invasion des cellules végétales, la différenciation en bactéroïde fixateur et finalement la rupture symbiotique. Afin de mieux comprendre les mécanismes d‘adaptation rapide développés par S. meliloti lors de la symbiose, nous nous sommes intéressées au rôle des systèmes Toxine-Antitoxine (TA) bactériens de type VapBC dans ce processus. Ces modules, composés d’une toxine et de son antitoxine apparentée, sont associés chez les bactéries pathogènes à la réponse aux stress et à l’adaptation à la vie intracellulaire. La toxine, de par son activité RNase site-spécifique, permet une inhibition globale ou partielle de la traduction. Chez S. meliloti, 11 systèmes VapBC chromosomiques putatifs ont été identifiés et deux seulement (VapC4 et VapC5) ont été caractérisés en interaction symbiotique. Au cours de cette thèse, nous avons tout d’abord démontré, par une approche de validation fonctionnelle, que les neuf systèmes VapBC prédits sont des modules Toxine/Antitoxine. Puis, afin d’évaluer le rôle de chaque système dans la symbiose, des mutants d’invalidation du gène de la toxine VapC ont été construits et analysés en interaction avec M. truncatula. Trois mutants (vapC3, vapC7 et vapC10) présentent, à 6 semaines post-inoculation, une amélioration de la capacité fixatrice d’azote des nodosités par rapport au sauvage. Les mutants vapC3 et vapC7 présentent également un nombre et une taille de nodosités supérieurs. Ces mutants, en augmentant l’apport azoté global de la plante, conduisent à une augmentation du rendement végétal. Le mutant vapC10, quant à lui, présente une amélioration de la viabilité bactérienne associée à une sénescence retardée, sans amélioration du rendement végétal en raison d’un nombre inférieur de nodosités par plante. Ainsi, nous démontrons que la bactérie, par l’intermédiaire des systèmes VapBC, participe à la régulation de l’interaction symbiotique. Les toxines VapC3 et VapC7, dans un contexte sauvage, limitent la prolifération et/ou l’infection bactérienne tandis que la toxine VapC10 diminue la viabilité bactéroïdienne. Afin d’identifier les cibles moléculaires des ribonucléases VapC7 et VapC10, nous avons développé une analyse de MORE RNA-seq (Mapping by Overexpression of an RNase in E. coli). Cette technique permet de déterminer, par leur extrémité 5’, les ARN clivés après surexpression chez E. coli des toxines de S. meliloti. Les toxines VapC7 et VapC10, clivent respectivement l’ARNtfMet et deux ARNtSer d’E. coli permettant ainsi, une inhibition globale ou partielle de la traduction. Des ARNt homologues ont été identifiés chez S. meliloti par analyse bio-informatique. Il en résulte que le gène spécifiant l’ARNtfMet initiateur de la traduction, jusqu’alors non formellement identifié chez S. meliloti, serait présent en trois copies sur les trois loci rrn chromosomiques. En conclusion, les toxines VapC7 et VapC10 de S. meliloti sont des tRNAses impliquées dans la reprogrammation métabolique de S. meliloti lors de la symbiose et intervenant dans la régulation de l’interaction symbiotique, probablement en réponse aux besoins azotés, énergétiques et spécifiques de sa plante hôte.

During the nitrogen-fixing symbiosis between the model legume Medicago truncatula and the rhizobiaceae Sinorhizobium meliloti, bacteria, differentiated into bacteroids within the nodule, reduce atmospheric nitrogen (N2) into ammonia (NH3), directly available by the plant. In exchange, the plant provides to its symbiont an ecological niche and carbohydrate substrates. Throughout the interaction, bacteria are faced with changing microenvironments from the soil free-living, the infection, the invasion of plant cells, the fixing-bacteroid differentiation and lastly the symbiotic rupture.To better understand the fast adaptation mechanisms developed by S. meliloti during the symbiosis, we were interested in the role of bacterial Toxin-Antitoxin (TA) systems in this process. These systems that are composed of a toxin and its cognate antitoxin, are associated with pathogenic bacteria to stress response and intracellular lifestyle adaptation. Through its site-specific RNase activity, the toxin allows a global or partial inhibition of the translation. In S. meliloti, 11 putative chromosomic VapBC systems have been identified and only two (VapC4 et VapC5) have been characterized in symbiotic interaction. During this PhD, using a functional validation approach, we have first demonstrated that the nine predicted VapBC systems are Toxin/Antitoxin modules. Then, to assess the role of each system in the symbiosis, mutants were constructed by the invalidation of the VapC toxin gene and analyzed in interaction with M. truncatula. Three mutants (vapC3, vapC7 et vapC10) show, at 6 weeks post-inoculation, a nitrogen fixation capacity improved within the nodules compared to the wild type. The vapC3 and vapC7 mutants also display a higher number and size of nodules. By increasing the global nitrogen supply of the plant, these mutants lead to an improved plant yield. The vapC10 mutant, for its part, enhances bacterial viability associated to a delayed senescence, without a plant yield improvement due to a lower number of nodules per plant. Hence, we have demonstrated that bacteria, through VapBC systems, take part in the symbiotic interaction regulation. While VapC3 and VapC7 toxins limit the bacterial proliferation and/or infection in a wild type context, VapC10 toxin decreases bacteroid viability.Then, to identify molecular targets of VapC7 and VapC10 ribonucleases, we have developed a MORE RNA-seq analysis (Mapping by Overexpression of an RNase in E. coli). This technic allows to determine, by their 5’-end, cleaved RNA after the S. meliloti toxins overexpression in E. coli. The VapC7 and VapC10 toxine, cleave respectively tRNAfMet et two tARNSer in E. coli, therefore allowing, a global o partial inhibition of translation. Homologous tRNA have been identified in S. meliloti by a bioinformatic analysis. As a result, the gene specifying the initiator tRNAfMet of translation, until now not formally identified in S. meliloti, would be present in three copies in the three chromosomic rrn loci. In conclusion, the VapC7 and VapC10 toxins are tRNAses involved in the metabolic reprogrammation of S. meliloti during the symbiosis and taking place in the symbiotic interaction regulation, probably in response to energy and specific nitrogen needs of its host plant.