Contribution des gènes des loci 5q11 et 11q23 à la multiciliogenèse et régulation de l’équilibre mucociliaire de l’épithélium des voies respiratoires au cours de la régénération in vitro

Contribution of the genes from the 5q11 and 11q23 loci to multiciliogenesis and regulation of mucociliary balance of the airway epithelium during in vitro regeneration

• Auteur / Autrice : Amélie Cavard
• Direction : Brice Marcet, Laure-Emmanuelle Zaragosi
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 29/05/2020
• Etablissement(s) : Université Côte d'Azur
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Côte d’Azur (2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de pharmacologie moléculaire et cellulaire (Sophia Antipolis, Alpes-Maritimes)
• Jury : Président / Présidente : Xavier Gidrol
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Xavier Gidrol, Bénédicte Durand, Olivier Tabary, Pascal Barbry
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Bénédicte Durand, Olivier Tabary

Mots clés

Mots clés contrôlés

Maladies respiratoires

Épithélium

Mots clés libres

Épithélium

Maladies respiratoires

Cellules multiciliées

Single-cell RNA-seq

Epithelium

Airway diseases

Multiciliated cells

Single-cell RNA-seq

Résumé

Les voies respiratoires sont bordées par un épithélium mucocilié constitué majoritairement de cellules basales, de cellules à mucus et de cellules multiciliées portant des centaines de cils motiles à leur pôle apical. Leur battement coordonné permet d’expulser les particules inhalées piégées dans le mucus. En cas de lésions, l’épithélium a la capacité de se régénérer à l’identique en maintenant un équilibre strict entre les proportions de chaque type cellulaire. Dans les maladies respiratoires chroniques comme la mucoviscidose, les inflammations et infections chroniques provoquent un remodelage de cet épithélium caractérisé par une hyperplasie sécrétoire et une perte progressive des cellules multiciliées.Mon travail de thèse a consisté à apporter une meilleure compréhension des mécanismes contrôlant la régénération de l’épithélium respiratoire, prélude essentiel au développement de futures thérapies régénératives. Nous avons utilisé un modèle in vitro de culture d’épithélium des voies respiratoires humaines ou murines associé à des approches de séquençage haut-débit telles que le séquençage d’ARN sur cellules uniques.La différenciation des cellules multiciliées à partir de cellules progénitrices requiert la génération de cils motiles, processus appelé multiciliogenèse. Mon laboratoire d’accueil a été le premier à démontrer que ce processus est contrôlé par les microARN miR-34b/c et miR-449a/b/c, ainsi que par CDC20B, gène hôte des miR-449 localisé sur le locus génomique humain 5q11. D’autres études ont montré par la suite que les gènes MCIDAS et CCNO, localisés à proximité de CDC20B/miR-449 sur le locus 5q11, contrôlent également la multiciliogenèse, faisant de ce locus un « hot spot » de régulateurs de multiciliogenèse.Dans une première partie de mes travaux, nous avons identifié et caractérisé des variants des microARN miR-34/449, appelés isomiR-34/449. Ces isomiR, partageant certaines fonctions avec leurs homologues « canoniques », ont aussi des fonctions distinctes, et représentent ainsi un mécanisme additionnel de régulation de la multiciliogenèse.Dans une deuxième partie de ma thèse, j’ai montré par analogie au locus 5q11, que les 3 gènes (C11orf88, LAYN et BTG4) les plus proches de la région génomique des miR-34b/c (locus 11q23) sont tous trois exprimés dans les cellules multiciliées. C11orf88, protéine de fonction inconnue, est fortement détectée dans les cils motiles, lui suggérant un rôle dans la fonction ciliaire. Ainsi, ce locus 11q23 constituerait également un autre « hot spot » de régulateurs de la multiciliogenèse.Enfin, une dernière partie de mes travaux a contribué à établir une cartographie transcriptomique des différents types cellulaires au cours des différentes étapes de la régénération de l’épithélium respiratoire. Ceci nous a permis (1) d’identifier une nouvelle trajectoire de différenciation des cellules à mucus en cellules multiciliées et (2) de révéler des différences significatives selon le milieu de culture de prolifération et de différenciation utilisé, sur la structure de l’épithélium, la composition cellulaire, et sur les profils d’expression génique des différents types cellulaires.L’ensemble de mes travaux a permis d’apporter une compréhension plus complète des mécanismes moléculaires mis en jeu lors de la régénération de l’épithélium respiratoire, et a fourni de nouveaux gènes candidats comme régulateurs potentiels de la multiciliogenèse.

Airways are lined by a pseudostratified mucociliated epithelium which is mainly composed of basal, goblet and multiciliated cells harboring hundreds of motile cilia at their apical part. Their coordinated beating allows the expulsion of inhaled particles that get trapped in the mucus. Following tissue lesions, the epithelium must regenerate, and maintain a strict balance between proportions of each cell type. In chronic respiratory diseases, such as cystic fibrosis, chronic infections and inflammation lead to tissue repair defects and airway epithelium remodeling, characterized by secretory hyperplasia and progressive loss of multiciliated cells.My PhD project aimed to improve our knowledge about mechanisms controlling the airway epithelium regeneration, which is a required step to the development of future regenerative therapies. We have used an in vitro cell culture model of human and murine airway epithelia and have performed single-cell RNA-sequencing approaches.Multiciliated cells differentiate from progenitors to generate multiple motile cilia, a process called multiciliogenesis. My host laboratory has previously demonstrated that this process is controlled by both miR-34b/c and miR-449a/b/c microRNAs, together with CDC20B, miR-449 host gene which is localized in the 5q11 human genomic locus. This 5q11 locus was further established as a hot spot of multiciliogenesis regulators.In a first part of my work, we identified and characterized variants of miR-34/449 microRNAs, called isomiR-34/449. These isomiRs, sharing certain functions with their “canonical” counterparts, also have distinct functions, and thus represents an additional mechanism for regulating multiciliogenesis.In a second part of my thesis, I have demonstrated, by analogy to the 5q11 locus, that the 3 nearest genes (C11orf88, LAYN and BTG4) located in the genomic region of miR-34b/c (11q23 locus) were also expressed in multiciliated cells. Importantly, C11orf88, a protein of unknown function, was highly and exclusively expressed in motile cilia of multiciliated cells, suggesting a role in ciliary function. This 11q23 locus may constitute an additional hot spot of multiciliogenesis regulators.Finally, a last part of my work contributed to established a transcriptomic cartography of distinct cell types during the constitutive steps of airway epithelium regeneration. This allowed us to (1) identify a new differentiation trajectory from goblet to multiciliated cells and (2) reveal that proliferation and differentiation cell culture media yield significant differences on epithelia morphology, cell composition and on the gene expression profiles of these distinct cell types.Altogether data gathered during my PhD work have allowed to unravel new molecular mechanisms involved in airway epithelium regeneration, and has provided novel candidate genes as potential regulators of multiciliogenesis.