Caractérisation structurale de l'architecture des parois fongiques par RMN du solide

Structural characterization of fungal cell walls architecture by solid-state NMR

• Auteur / Autrice : Gaëlle Lamon
• Direction : Antoine Loquet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie Physique
• Date : Soutenance le 18/12/2020
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences chimiques (Talence, Gironde ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (Bordeaux ; 2007-....)
• Jury : Président / Présidente : Erick Joël Dufourc
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Antoine Loquet, Erick Joël Dufourc, Sabine Hediger, Isabelle Marcotte, Matthieu Chavent, Derrick Robinson
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sabine Hediger, Isabelle Marcotte

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cryptococcus neoformans

Paroi cellulaire

Résonance magnétique nucléaire

Aspergillus fumigatus

Mots clés libres

Aspergillus fumigatus

Rmn

Paroi cellulaire

Cryptococcus neoformans

Aspergillus fumigatus

Nmr

Cell wall

Cryptococcus neoformans

Résumé

Il existe une grande variété de champignons pathogènes humains qui sont à l’origine de maladies bénignes à mortelles. La plupart du temps, ces infections sont associées à d’autres pathologies ou traitements médicaux comme l’asthmes, les leucémies, les transplantations d’organes, le SIDA ou les traitement immunosuppresseurs à base de corticostéroides. Malgré le nombre important de décès et le nombre grandissant d’occurrence des mycoses sévères à travers le monde, les infections fongiques sont encore négligées par les autorités sanitaires.Parmi ces pathogènes fongiques, le champignon filamenteux Aspergillus fumigatus est un des pathogènes principaux du système respiratoire. L’aspergillose, dont les taux de d’infection et de mortalité demeurent élevés, devient un enjeu de santé publique. Les spores d’A. fumigatus sont entourés d’une paroi, essentielle pour leur croissance et leur permettant de résister face au système immunitaire de l’hôte. Cette paroi est composée d’un réseau de polysaccharides recouvert d’un pigment appelé DHN-mélanine et d’une couche de protéines appelées hydrophobines. Ce projet a pour but d’établir l’architecture structurale de la paroi des spores d’A. fumigatus à l’échelle atomique en utilisant la RMN du solide (ssNMR) en rotation à l’angle magique (MAS).D’un autre côté, Cryptococcus neoformans est l’agent pathogène responsable de la cryptococcose ; une mycose affectant le système nerveux central. Cette maladie fongique est, encore de nos jours, une cause significative de mortalité à travers le monde puisqu’elle entraîne de graves symptômes tels que la méningo-encéphalite ; particulièrement fréquente chez les patients déjà infectés par le VIH. C. neoformans se présente sous la forme d’une cellule encapsulée de 5 à 7 μm de diamètre entourée d’une paroi et d’une capsule. Cette paroi, rigide, est liée à la membrane plasmique et composée de polymères d’α-glucan, de β-glucan, de chitine et de chitosan. De plus, la capsule de C. neoformans est majoritairement composée de carbohydrates tels que le glucuronoxylomannan (GXM) (jusqu’à 90 %) ou le glucuronoxylomannogalactan (GXMGal) mais aussi de mannoprotéines et de lipides. Le but de ce projet de thèse est d’identifier les différents composants de la paroi mais aussi de la capsule de C. neoformans par ssNMR et d’établir l’architecture de ces deux entités. Un des aspects de ce projet est aussi d’explorer les possibilités et les limitations des méthodes de détection proton en RMN couplée à un MAS élevé (100 kHz) comme outil d’analyse des parois fongiques.En résumé, puisque la RMN des solides est une méthode de spectroscopie non invasive, nous avons appliqué ce type d’analyses dans le cadre de l’étude de l’architecture moléculaire de systèmes complexes (parois fongiques, capsules, …) dans des conditions aussi proches que possible de l’état natif des cellules. Pendant ces trois années de thèse, nous avons mis en place une méthodologie robuste et rapide permettant d’étudier la composition complexe des structures externes présentes dans les cellules fongiques ainsi que leur architecture au sein des cellules entières. De plus, puisque dans le cadre des infections microbiennes la pathogénicité du microbe repose souvent sur les structures externes des cellules infectieuses, les résultats obtenus au court de cette thèse, apportant une meilleure compréhension de l’organisation cellulaire d’A. fumigatus et C. neoformans, pourraient ainsi être utilisés dans le cadre du développement et de la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques afin de combattre plus efficacement ces infections fongiques.

There is a broad range of fungal pathogen infecting humans and causing diseases that can be from mild to lethal. Severe fungal infections are due to opportunistic pathogens that infect immunosuppressed individuals and are most of the time associated with other diseases or medical conditions such as asthma, leukemia, organ transplants, AIDS or immunosuppressive corticosteroid therapies. Despite the number of deaths and the increase in severe mycosis, fungal infections remain neglected by public health authorities.Among fungal pathogens, the filamentous fungus Aspergillus fumigatus is one of the major pathogen of the respiratory system. Aspergillosis displaying both high incidence and mortality rates, is becoming a massive public health issue. The spores of Aspergillus fumigatus are surrounded by a cell wall, essential for their growth and allowing them to resist against host defense mechanisms. The cell wall is composed of a set of polysaccharides covered by the DHN-melanin pigment and a layer of proteins called hydrophobins. In this project, we aimed at investigated the structural architecture of Aspergillus fumigatus cell wall at atomic resolution using MAS ssNMR spectroscopy.In another hand, Cryptococcus neoformans is the etiological agent of cryptococcosis; which consists in mycosis affecting the central nervous system. This fungal disease remains a significant cause of mortality worldwide by leading to severe symptoms such as meningoencephalitis - especially for immunocompromised individuals suffering from AIDS. C. neoformans results in encapsulated particles with a size of 5-7μm with a two-layers external structure composed of a cell wall and a capsule. The cell wall, rigid, is bounded to the plasma membrane and composed of polymers of α-glucan, β-glucan, chitin and chitosan45. Then, the capsule of C. neoformans is mainly composed of carbohydrates such as glucuronoxylomannan (GXM) (up to 90%), glucuronoxylomannogalactan (GXMGal), mannoproteins and lipids. During this thesis project, we aimed at identifying the different components of C.neoformans cell wall and capsule by ssNMR and to investigate the architecture of these two layers. Part of this project was also the exploration of possibilities and limits of 1H detection methods at fast MAS regime (100 kHz) as the tool to analyze intact cell walls.To sum up, as the solid-state NMR is a non-destructive spectroscopy, we applied this method to the study of the molecular architecture of complex systems (cell wall, capsule…) in cellular conditions – as close as possible to the native state. During these three years, we set up a methodology allowing studying the complex composition of fungal external structures as well as their architecture in the cell context. Finally, because in microbial infections, the pathogenesis often relies on the external structures of the pathogen, all these results could give a better comprehension of the A. fumigatus and C. neoformans cell organization that may help to find new therapeutic strategies to fight, more efficiently, against fungal infections.