Développement de méthodes analytiques pour l’analyse d’oligonucléotides thérapeutiques bio-conjugués à des lipides

Development of analytical methods for the analysis of therapeutic oligonucleotides bioconjugated to lipids

• Auteur / Autrice : Fatima Barakat
• Direction : Karen Gaudin, Ludivine Ferey
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie Analytique et Environnementale
• Date : Soutenance le 11/12/2020
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences chimiques (Talence, Gironde ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Acides Nucléiques : Régulations Naturelle et Artificielle
• Jury : Président / Présidente : Eric Peyrin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Karen Gaudin, Ludivine Ferey, Myriam Taverna, François Couderc, Arnaud Gissot
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Eric Peyrin, Myriam Taverna

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chimie supramoléculaire

Électrophorèse capillaire

Chromatographie en phase liquide

Oligonucléotides

Mots clés libres

Oligonucléotides lipidiques

Chromatographie liquide

Électrophorèse capillaire

Chromatographie d’exclusion stérique

Assemblages supramoléculaires

Lipid oligonucleotides

Liquid chromatography

Capillary electrophoresis

Size exclusion chromatography

Supramolecular assemblies

Résumé

Les oligonucléotides antisens (ASO) ont la capacité d’inhiber ou de moduler l’expression d’un gène cible par différents mécanismes. La bioconjugation de l’ASO avec un lipide est une approche très prometteuse qui a montré une amélioration de la délivrance de la séquence antisens et par conséquent, de l’efficacité thérapeutique de l’oligonucléotide. Ces nouveaux agents thérapeutiques, les oligonucléotides lipidiques (LON), sont des molécules amphiphiles capables de s’auto-assembler sous forme d’objets supramoléculaires. Leur développement pharmaceutique requiert des méthodes analytiques adaptées pour évaluer la pureté des LON synthétisés et pouvoir les quantifier dans les formulations mais aussi pour caractériser les assemblages supramoléculaires formés.Dans ce travail, différentes méthodes ont été évaluées en chromatographie liquide (HPLC) à polarité de phase inversée par appariement d’ions et à interactions hydrophiles, en électrophorèse capillaire (CE) et en chromatographie d’exclusion stérique (SEC) pour l’analyse de LON de structures chimiques variées. Malgré les nombreux paramètres étudiés, l’asymétrie des pics obtenus en HPLC, limite son utilisation à des fins de dosage. En revanche, une méthode quantitative a été développée et validée en CE en présence de cyclodextrines (CD). La constante de complexation entre le LON libre et les CD ainsi que la mobilité électrophorétique du complexe ont été déterminées. Enfin, le potentiel de la SEC et de la CE pour la caractérisation des objets supramoléculaires de LON a été évalué.

Antisense oligonucleotides (ASO) have the ability to inhibit or modulate the expression of a target gene by various mechanisms. Bioconjugation of ASO with a lipid is a very promising approach which has shown an improvement in the delivery of the antisense sequence and therefore, in the therapeutic efficacy of the oligonucleotide. These new therapeutic agents, lipid oligonucleotides (LON), are amphiphilic molecules and are able to self-assemble to form supramolecular objects. Their pharmaceutical development requires suitable analytical methods to study the purity of the LONs synthesized and to be able to quantify them in the formulations but also to characterize the supramolecular assemblies formed.In this work, different methods were investigated in ion-pairing reversed-phase HPLC and hydrophilic interaction chromatography, capillary electrophoresis (CE) and size exclusion chromatography (SEC) for LON analysis with various chemical structures. Despite the different parameters studied, the asymmetry of the peaks obtained by HPLC limits its use for assays. On the other hand, a quantitative method has been developed and validated in CE in the presence of cyclodextrins (CD). The complexation constant between free LON and CDs as well as the electrophoretic mobility of the complex were determined. Finally, the potential of SEC and CE for the characterization of supramolecular objects of LON was assessed.