Modèles levure de maladies associées au gène mitochondrial ATP6 : bases moléculaires et perspectives thérapeutiques

Yeast models of diseases linked to the mitochondrial ATP6 gene : molecular bases and therapeutic prospects

• Auteur / Autrice : Xin Su
• Direction : Déborah Tribouillard-Tanvier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Cellulaire et Physiopathologie
• Date : Soutenance le 26/11/2020
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biochimie et génétique cellulaires (Bordeaux)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Pierre Mazat
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Déborah Tribouillard-Tanvier, Jean-Pierre Mazat, Vincent Procaccio, Véronique Paquis-Flucklinger, Philippe Diolez
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Vincent Procaccio, Véronique Paquis-Flucklinger

Mots clés

Mots clés contrôlés

Polymorphisme génétique

Troubles du métabolisme des glucides

ATP synthase

Mitochondriopathies

Mots clés libres

Maladies mitochondriales

ATP synthase

Gène ATP6

Suppresseurs génétiques

Suppresseurs pharmacologiques

Mitochondrial diseases

ATP synthase

ATP6 gene

Genetic suppressors

Pharmacological suppressors

Résumé

Par définition, les maladies mitochondriales résultent d’un défaut dans le processus des oxydations phosphorylantes (OXPHOS). Celui-ci permet aux cellules de se fournir en ATP, soit la principale source d’énergie qu’elles peuvent utiliser. Dans ce processus, quatre complexes (I-IV) insérés dans la membrane mitochondriale interne transfèrent à l’oxygène moléculaire les équivalents réducteurs libérés par l’oxydation de carbohydrates et d’acides gras. Cette activité génère une force proton motrice utilisée pour la synthèse d’ATP à partir d’ADP et de phosphate inorganique par le complexe V ou ATP synthase.Des maladies dont NARP (Neuropathy Ataxia Retinitis Pigmentosa) et MILS (Maternally Inherited Leigh Syndrome) ont été associées à des mutations de la sous-unité a de l’ATP synthase. Son gène (ATP6) est dans le génome mitochondrial. Celui-ci est présent jusqu’à plusieurs milliers de copies par cellule. Les mutations du gène ATP6 coexistent souvent avec des copies sauvages du génome mitochondrial dans les cellules et tissus des patients, ce qui rend leur étude difficile. La levure Saccharomyces cerevisiae dont on peut modifier à loisir le génome mitochondrial permet de s’affranchir de cette hétérogénéité génétique (appelée hétéroplasmie). De plus, grâce à sa bonne capacité fermentaire, elle est capable de survivre à l’inactivation du système OXPHOS.J’ai au cours de ma thèse exploité ces caractéristiques pour mieux définir les conséquences sur l’ATP synthase de cinq mutations du gène ATP6 identifiées chez des patients : m.8993T>G, m.9191T>C, m.8969G>A, m.8909T>C, et m.9166T>C. Le pouvoir pathogène des trois premières a été établi. Les deux dernières sont des nouveaux variants de l’ADN mitochondrial. Via l’identification de suppresseurs intragéniques, et à la lumière de structures à haute résolution de l’ATP synthase décrites récemment, j’ai pu définir les bases moléculaires des mécanismes pathogènes induits par les mutations m.8993T>G, m.9191T>C, et m.8969G>A. Le variant m.8909T>C a été identifié en combinaison avec une mutation pathogène bien connue dans un ARN de transfert (m.3243A>G). Nous avons trouvé qu’un équivalent de cette nouvelle mutation a en levure des effets délétères sur l’assemblage ou la stabilité de la sous-unité a comparables à ceux induits par des mutations du gène ATP6 (m.8993T>C, m.9176T>C) dont le pouvoir pathogène a été établi, et qu’elle a donc potentiellement la capacité d’affecter seule la santé humaine. Mes études en levure sont cohérentes avec des études ayant conclu récemment à la pathogénicité du variant m.9166T>C et permettent de mieux comprendre comment il impacte l’ATP synthase.J’ai identifié un mécanisme de suppression actif sur des modèles levure de mutations pathogènes de la sous-unité a. Il implique le transporteur des oxodicarboxylates (Odc1) localisé dans la membrane mitochondriale interne. J’ai trouvé que la surexpression d’Odc1 permet une plus grande activité du cycle de Krebs (ou TCA). Ce cycle intervient dans l’oxydation de substrats organiques dont les équivalents réducteurs sont ensuite transférés à l’oxygène par la chaîne respiratoire. Il tourne à bas régime dans les mutants de l’ATP synthase dont l’activité canal à protons est altérée. La suppression-Odc1 dépendante entraîne un découplage partiel de la membrane interne, de sorte que le cycle TCA est stimulé malgré le défaut en ATP synthase. Cet effet permet une plus grande production d’ATP via la phosphorylation d’ADP couplée directement à une des réactions du cycle de Krebs. Ces résultats ouvrent des perspectives intéressantes pour le traitement des maladies associées à des altérations de l’ATP synthase, et possiblement d’autres désordres métaboliques. Cette étude apporte de plus un éclairage nouveau sur le contrôle de la biogenèse du complexe IV par l’ATP synthase.

By definition, mitochondrial diseases result from a defect in the process of oxidative phosphorylation (OXPHOS). This is responsible for the production of ATP, the main source of cellular energy. In this process, four multiprotein complexes (I-IV) inserted into the inner mitochondrial membrane transfer to molecular oxygen the reducing equivalents released by the oxidation of carbohydrates and fatty acids. This activity generates a proton motive force used for the synthesis of ATP from ADP and inorganic phosphate by the Complex V or ATP synthase.Diseases including NARP (Neuropathy Ataxia Retinitis Pigmentosa) and MILS (Maternally Inherited Leigh Syndrome) have been associated with mutations in the subunit a of ATP synthase. Its gene (ATP6) is in the mitochondrial genome. This genome is present in up to several thousand copies per cell. Mutations in the ATP6 gene often coexist with wild-type copies of the mitochondrial genome in patients' cells and tissues (heteroplasmy), which makes their study difficult. The yeast Saccharomyces cerevisiae, whose mitochondrial genome can be modified at will, makes it possible to overcome this genetic heterogeneity owing to its incapacity to stably maintaining heteroplasmy. In addition, thanks to its good fermentation capacity, this organism is able to survive mutations that inactivate the OXPHOS system.During my thesis, I exploited these characteristics to better define the consequences on ATP synthase of five ATP6 gene mutations identified in patients: m.8969G>A, m.9191T>C, m.8993T>G, m.8909T>C, and m.9166T>C. The pathogenicity of the first three has been established. The last two are new mitochondrial DNA variants. Through the identification of intragenic suppressors, and in the light of high-resolution structures of ATP synthase described recently, I was able to define the molecular bases of the pathogenic mechanisms induced by the m.8993T>G, m.9191T>C and m.8969G>A mutations. The m.8909T>C variant was identified in combination with a well-known pathogenic mutation in tRNALeu (m.3243A>G). We have found that an equivalent of this new mutation in yeast has deleterious effects on the assembly/stability of the subunit a comparable to those induced by mutations of the ATP6 gene (m.8993T>C, m.9176T>C) with a well-established pathogenicity, and therefore has the potential to affect human health on its own. My studies in yeast are consistent with studies that recently concluded on the pathogenicity of the m.9166T>C variant and allow to better understand how it impacts ATP synthase.I have identified an active suppressor mechanism in yeast models of pathogenic subunit a mutations. It involves the oxodicarboxylate transporter (Odc1) located in the inner mitochondrial membrane. I have found that artificially overexpressing Odc1 allows for greater Krebs cycle (or TCA) activity. This cycle is involved in the oxidation of organic substrates whose reducing equivalents are then transferred to oxygen by the respiratory chain. It runs low in ATP synthase mutants with impaired proton channel activity. The Odc1-dependent suppressor activity results from a partial uncoupling of the inner membrane so that the TCA cycle is stimulated despite the presence of defect in ATP synthase. This effect allows a greater production of ATP via ADP phosphorylation coupled with one of the reactions of the Krebs cycle. These results open interesting perspectives for the treatment of diseases associated with alterations in ATP synthase, and possibly other metabolic disorders. This study also sheds new light on the control of complex IV biogenesis by ATP synthase.