UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP) : import dans les glycosomes et implication dans la biosynthèse glycosomale et cytosolique des sucres nucléotidiques chez Trypanosoma brucei

UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP) : import into glycosomes and implication in glycosomal and cytosolic nucleotide sugar biosynthetic pathways in Trypanosoma brucei

• Auteur / Autrice : Oriana Villafraz
• Direction : Frédéric Bringaud
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie -immunologie
• Date : Soutenance le 04/12/2020
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Microbiologie fondamentale et pathogénicité (Bordeaux)
• Jury : Président / Présidente : Sébastien Mongrand
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Frédéric Bringaud, Sébastien Mongrand, Wolfgang Schliebs, Mick Urbaniak, Paul Michels
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Wolfgang Schliebs, Mick Urbaniak

Mots clés

Mots clés contrôlés

Trypanosomiase africaine

Glycosylation

Insectes parasites

Parasitoses

UDP-glucose-pyrophosphorylase

Trypanosoma brucei

Mots clés libres

Trypanosoma brucei

Glycosome

UDP-Glucose

Formes procycliques

Mitochondrie

Piggybacking

Trypanosoma brucei

Glycosome

UDP-Glucose

Procyclic forms

Piggybacking

Mitochondria

Résumé

Trypanosoma brucei, un protiste responsable de la Trypanosomose Humaine Africaine, également connue sous le nom de la maladie du sommeil, est transmis par la mouche tsé-tsé (Glossina sp.). La découverte d'organites de type peroxysome spécialisés dans la glycolyse, appelés glycosomes, a soulevé un certain nombre de questions sur le rôle de cet organite dans la biologie des trypanosomes. Plusieurs voies métaboliques présentes dans le cytosol d'autres eucaryotes, comme la glycolyse et la biosynthèse des sucres nucléotidiques, sont compartimentées dans les glycosomes. Les raisons et les avantages de la présence des enzymes glycolytiques dans l'organite ont été largement discutés, mais la fonctionnalité et le rôle des voies de biosynthèse des sucres nucléotidiques glycosomales ne sont pas connus. Notre étude s'est focalisée sur l'UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP), une enzyme impliquée dans la synthèse de l'UDP-glucose (UDP-Glc). Sur la base de la double localisation glycosomale et cytosolique de l'UGP mise en évidence ici à l'aide de plusieurs techniques de localisation subcellulaire, nous avons abordé deux questions en utilisant comme modèle les formes procycliques de T. brucei présentes dans l'insecte vecteur. La première est liée au mécanisme d'import de l'UGP dans les glycosomes, car cette protéine ne possède aucun signal d'adressage aux peroxysomes de type PTS1 ou PTS2. Nous avons montré que l'UGP est importée dans les glycosomes par "piggybacking" en s'associant à la phosphoénolpyruvate décarboxylase (PEPCK) possédant un signal d’adressage PTS1. Les interactions entre l'UGP et la PEPCK ont été montrées in situ et l'identification les régions impliquées dans ces interactions ont été identifiées. Nos résultats suggèrent que le complexe UGP-PEPCK est formé de manière transitoire lors de son import dans les glycosomes nouvellement produits et compétents pour l'import des protéines. La seconde question concerne le rôle de l'UGP dans les glycosomes. Nous avons montré que l'UGP est essentielle à la croissance des trypanosomes et que les voies métaboliques glycosomales et cytosoliques dont l'UGP fait partie sont fonctionnelles. En effet, des mutants viables contenant l'UGP exclusivement dans les glycosomes ou dans le cytosol sont viables et produisent des quantités similaires d'UDP-Glc. La raison d'être de la production glycosomale d'UDP-Glc par l'UGP reste inconnue, mais n'est probablement pas liée aux réactions de glycosylation, étant donné qu'aucune glycosyltransférase n'a été détectée dans l'organite.Un autre aspect de ce travail concerne le rôle des intermédiaires du cycle de l'acide tricarboxylique (TCA) dans le métabolisme mitochondrial des formes procycliques. Dans le tractus digestif de son insecte vecteur, les trypanosomes dépendent de la proline pour alimenter leur métabolisme énergétique. Cependant, la disponibilité d'éventuelles autres sources de carbone pouvant être utilisées par le parasite est actuellement inconnue. Nous avons montré que les intermédiaires du cycle TCA, i.e. succinate, malate et a-cétoglutarate, stimulent la croissance des formes procycliques incubées dans un milieu contenant 2 mM de proline, concentration se situant dans la gamme des quantités mesurées dans l'intestin de la mouche. De plus, le développement de nouvelles approches ont permis d'étudier une branche peu explorée du cycle TCA convertissant le malate en a-cétoglutarate, précédemment décrite comme peu ou pas utilisée par le parasite, quellles que soient les quantités de glucose disponibles. L'activité de cette branche suggère qu'un cycle TCA complet peut être mis en œuvre dans les formes procycliques et probablement dans les autres formes parasitaires de l'insecte. Nos données élargissent le potentiel métabolique des trypanosomes et ouvrent la voie vers une meilleure compréhension du métabolisme de ce parasite dans divers organes de la mouche tsé-tsé, où il évolue.

Trypanosoma brucei, a protist responsible for human African trypanosomiasis, also known as sleeping sickness, is transmitted by the tsetse fly (Glossina sp.). The discovery of peroxisome-like organelles specialized in glycolysis called glycosomes, has raised a number of questions about the role of this organelle in the biology of trypanosomes. Several metabolic pathways present in the cytosol of eukaryotes, like glycolysis and sugar nucleotides biosynthesis, are compartmentalized within glycosomes. While the reasons and advantages of having glycolytic enzymes compartmentalized in the organelle have been extensively discussed, little is proposed for sugar nucleotides biosynthetic pathways. This study is focused on the UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP), an enzyme involved in the synthesis of UDP-glucose (UDP-Glc). Based on the UGP's dual glycosomal and cytosolic localization evidenced here using several subcellular localization techniques, we addressed two questions using as a model the procyclic forms of T. brucei present in the insect vector. The first one is related to the mechanism of UGP import into glycosomes, since this protein lacks any known peroxisomal targeting signal (PTS1 and PTS2). We demonstrated that UGP is imported into the organelle by piggybacking on the glycosomal PTS1-containing phosphoenolpyruvate decarboxylase (PEPCK). Interactions between UGP and PEPCK have been showed in situ and the interacting regions have been identified. Our data suggest that the complex UGP-PEPCK is formed transiently to facilitate the import of UGP and that it is detected in newly formed import-competent glycosomes. The second question concerns the role of UGP in glycosomes. We demonstrated that UGP is essential for the growth of trypanosomes and that mutants containing UGP exclusively in glycosomes or in the cytosol still produce UDP-Glc at similar levels and are viable, which implies that the glycosomal and cytosolic metabolic pathways involving UGP are functional. The glycosomal function of UDP-Glc is currently unknown and probably not related to glycosylation reactions, since no glycosyltransferases have been detected in the organelle.Another aspect of this work concerns the role of tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates in the mitochondrial metabolism of the procyclic trypanosomes. In the midgut of its insect vector, trypanosomes rely on proline to feed their energy metabolism. However, the availability of other potential carbon sources that can be used by the parasite is currently unknown. We showed that TCA cycle intermediates, i.e. succinate, malate and a-ketoglutarate, stimulate growth of procyclic trypanosomes incubated in medium containing 2 mM proline, which is in the range of the amounts measured in the midgut of the fly. In addition, we have implemented new approaches to study cell growth and metabolic pathways in order to investigate mitochondrial metabolism. These new tools have allowed us to study a poorly explored branch of the TCA cycle converting malate to a-ketoglutarate, which was previously described as non-functional or little used in the parasite, regardless of the glucose levels available. The discovery of this branch reveals that a full TCA cycle can operate in procyclic trypanosomes and probably in the other trypanosome forms present in the fly. Our data broaden the metabolic potential of trypanosomes and pave the way for a better understanding of the parasite's metabolism in various organ systems of the tsetse fly, where it evolves.