Étude du métabolisme de l'amidon dans le fruit tomate avec des approches de génétique directe et inverse

Study of starch metabolism in tomato fruit by using forward and reverse genetic approaches

• Auteur / Autrice : Jiaojiao Wang
• Direction : Yves Gibon, Pierre Baldet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Végétale
• Date : Soutenance le 27/11/2020
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie du fruit et pathologie
• Jury : Président / Présidente : Michel Hernould
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Yves Gibon, Pierre Baldet, Michel Hernould, Sylvie Dinant, Mohamed Zouine, Sarah Jane Cookson, Emmanuelle Issakidis-Bourguet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sylvie Dinant, Mohamed Zouine

Mots clés

Mots clés contrôlés

Arabidopsis

Fruits -- Maturation

Séquençage des acides aminés

Tomate

Amidons

Mots clés libres

Amidon

Fruit

Tomate

Mutant EMS

Cartographie-Par-Séquençage

Beta-Amylase

Starch

Fruit

Tomato

EMS mutant

Mapping-By-Sequencing

Beta-Amylase

Résumé

L’amidon joue un rôle central pendant le développement et la maturation des fruits. Sa dégradation fournit de l’énergie et des sucres aux fruits en maturation tandis que son accumulation répond aux stress environnementaux. La connaissance du métabolisme de l’amidon dans les feuilles s’est considérablement améliorée, principalement grâce à la caractérisation des mutants d’Arabidopsis (sans amidon ou excédentaire), mais on en sait très peu sur les fruits. Dans cette étude, nous avons utilisé des approches de génétique directe et inverse pour obtenir des mutants de tomate produisant des fruits avec un excès d’amidon.Pour mener la démarche de génétique directe, nous avons combiné l’utilisation d’une plateforme robotisée permettant le dosage d’amidon à haut-débit avec celle d’une importante population de mutants EMS, et réalisé un criblage en utilisant des fruits rouges de près de 3000 individus. Trois candidats avec un excès d’amidon ont été trouvés, dont un (P17C12) a ensuite été confirmé avec une mutation récessive. Une grande population BC1F2 a été phénotypée puis utilisée pour localiser la mutation en utilisant une approche de cartographie par séquençage. Les résultats de l’analyse ont montré que la localisation la plus probable de la mutation est à l’extrémité du chromosome 1, avec 1 mutation KO, 2 mutations « faux-sens » et de nombreuses mutations dans des régions non codantes. Nous avons décidé de tester la RecQ hélicase 4 (RECQ4, Solyc01g103960, KO), un membre de la famille des protéines de transport mitochondrial (MCF, Solyc01g095510, « faux-sens »), un transporteur de phospholipides à ATPase (PTA, Solyc01g096930, « faux-sens »), un ORF situé en 5’ d’une protéine de fonction inconnue (CPuORF, Solyc01g105700, 5’ UTR) et la Rubrédoxine (Solyc01g097910, 3’UTR). Nous avons créé des mutants homozygotes KO ou faux-sens en utilisant CRISPR/Cas9 pour les gènes candidats RECQ4, MCF et PTA, et des mutants homozygotes avec mutations d’insertion / suppression dans le 5’ UTR pour CPuORF, mais aucun n’a montré de phénotype avec excès d’amidon. Pour la Rubrédoxine, en plus de créer des mutants KO et des mutants avec des mutations similaires dans 3’ UTR avec CRISPR/Cas9, nous avons également produit des plantes surexprimant la Rubrédoxine car chez mutant PP17C12, l’ARNm de la Rubrédoxine était fortement exprimé dans le fruit vert des lignées BC1F1 et S2. Le développement du mutant KO pour la Rubrédoxine (homozygotes) ne va pas au-delà du stade cotylédon. Les mutants avec des mutations dans 3’ UTR, qui n’ont montré aucun changement dans la quantité d’amidon ou les niveaux d'ARNm de Rubrédoxine. Certaines plantes ont montré des expressions 100 fois plus élevées de Rubrédoxine dans les feuilles, mais aucune n’a montré d’augmentation significative de la quantité d'amidon dans les fruits. Finalement, nous n’avons trouvé le phénotype avec excès d’amidon dans les fruits pour aucun des cinq gènes candidats testés, ce qui implique que davantage d'investigations seront nécessaires pour affiner la cartographie et identifier la mutation responsable de ce phénotype.En utilisant une approche de génétique inverse, nous avons sélectionné une alpha-amylase (AMY3.2) et trois bêta-amylases (BAM1.2, BAM3.2 et BAM9), pour lesquelles nous avons créé des mutants KO par CRISPR/Cas9. Nous avons obtenu des mutants KO homozygotes pour AMY3.2 et BAM9, et des mutants KO hétérozygotes pour BAM1.2 et BAM3.2 dans la génération T1. L'absence de BAM9 a conduit à une mauvaise fertilisation menant à une réduction du nombre de graines et à une diminution de la taille des fruits chez la plupart des mutants. Chez ces mutants, la quantité d'amidon était remarquablement élevée dans les fruits âgés de 35 DAP. Ces résultats préliminaires suggèrent que BAM9 pourrait jouer un rôle important dans la viabilité du pollen et dans la dégradation de l’amidon des fruits pendant le mûrissement.

Starch plays a central role during fruit development and ripening. Its degradation provides energy and sugars in ripening fruits whereas its accumulation responds to environmental stresses, which suggests a buffering role. Knowledge of starch metabolism in leaves has dramatically improved, mostly through the characterization of Arabidopsis mutants (starch-less or -excessive), but only very little is known in fruits. In this study, we used both forward and reverse genetic approaches to obtain tomato mutants with starch-excess fruits.For applying forward genetics, we took advantages of the robotic platform and the large EMS mutant population of tomato (Micro-Tom, an ideal model for starch research), and performed a screen by using red fruits of nearly 3,000 individuals. Three starch-excess candidates were found and one (P17C12) could be confirmed as a homozygous mutant with a recessive starch-excess phenotype with Mendelian inheritance analysis. A large BC1F2 population was phenotyped and the starch-excess phenotype was mapped-by-sequencing. The sequence data obtained from the two bulks revealed that the mutation was likely located at the end of chromosome 1, a region that harbours 1 KO and 2 missense mutations as well as numerous mutations in non-coding regions. We decided to work with the KO, missense mutations and mutations in 5’ UTR and 3’ UTR first, which were a RecQ helicase 4 gene (RECQ4, Solyc01g103960), a mitochondrial carrier protein family gene (MCF, Solyc01g095510), a phospholipid-transporting ATPase gene (PTA, Solyc01g096930), a conserved peptide upstream open reading frame (CPuORF, Solyc01g105700), and a rubredoxin protein family gene (Solyc01g097910), respectively.To evaluate those mutations, we utilised different bioengineering techniques adapted to each case. We created KO or missense homozygous mutants by using CRISPR/Cas9 for RECQ4, MCF and PTA candidate genes, and homozygous mutants with insertion/deletion mutations in the 5’ UTR for CPuORF, but none of them showed a starch-excess phenotype. For Rubredoxin, besides creating KO mutants and mutants with similar mutations in 3’ UTR with CRISPR/Cas9, we also overexpressed Rubredoxin under the control of the 35S promoter as we found a significant increase of Rubredoxin mRNA in the 12 DAP (days after pollination) fruit of BC1F1 and S2 (P17C12), compared to the WT. The homozygous KO mutants could not grow through cotyledon stage, indicating that the lack of Rubredoxin is lethal for phototrophic plants. The mutants with mutations in 3’ UTR showed no changes in starch amount or mRNA levels of rubredoxin. Then, among the transformants overexpressing Rubredoxin, some showed 100 times higher expressions levels of Rubredoxin in leaves, but showed no significant starch increase in 20DAP fruit. Finally, none of the five candidate genes checked here led to a starch-excess phenotype in fruits, implying that more investigations are required regarding fine-mapping and mining the possible candidate genes.We also attempted to obtain starch-excess mutants via reverse genetics. We selected one alpha-amylase (AMY3.2) and three beta-amylases (BAM1.2, BAM3.2 and BAM9) to create the corresponding KO mutants by CRISPR/Cas9 techniques. We obtained homozygous KO mutants of AMY3.2 and BAM9, and heterozygous KO mutants of BAM1.2 and BAM3.2 in T1 generation. The mutants of two transgenic lines lacking AMY3.2 showed lower starch content in 20 DAP fruits. While the loss of BAM9 led to poor fertilization, and reduced seed numbers and fruit size in most mutants. Furthermore, in those mutants, starch levels were remarkably high in the ripening 35 DAP fruit. Then, in the red ripe fruit, mutants contained significant more glucose than WT fruits. Those results lead us to speculate that BAM9 may play important roles both in pollen viability and starch degradation during fruit ripening.