Étude de la mécanosensibilité moleculaire en combinant l'étirement cellulaire et la microscopie de super-résolution : le cas des sites d'adhésion intégrine-dépendant et du cytosquelette

Studying mechanosensing at the molecular level by combining cell stretching and super-resolution microscopy : the case of integrin adhesions and the cytoskeleton

• Auteur / Autrice : José Filipe Nunes Vicente
• Direction : Grégory Giannone
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 27/11/2020
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Interdisciplinaire de Neurosciences (Bordeaux)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sandrine Lévêque-Fort, Christophe Leterrier, Mireille Montcouquiol
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Manuel Théry, Carsten Grashoff

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cytosquelette

Protéines

Microscopie à super-résolution

Transduction du signal cellulaire

Mots clés libres

Mécano-Sensitivité

Sites d'adhésion intégrine-Dépendant (IAS)

Cytosquelette

Étirement cellulaire

Microscopie de super-Résolution

Suivi de proteínes individuelles

Mechanosensing

Integrin Adhesion Sites

Cytoskeleton

Cell Stretching

Super resolution microscopy

Single particle tracking

Résumé

La détection et la conversion des forces mécaniques en signaux biochimiques sont connues sous le nom de mécanotransduction. Des cellules aux tissus, les événements de mécanotransduction régulent la migration, la prolifération et la différenciation lors de processus physiologiques et pathologiques, tels que la réponse immunitaire, le développement et la formation de métastases. Les sites d'adhésion intégrine-dépendant (IAS) sont des structures complexes mécanosensibles essentielles qui régulent l'adhésion cellulaire, la signalisation intracellulaire et la transmission de force au cours de ces mêmes processus. La mécanosensibilité cellulaire est basée sur la déformation et la réorganisation des protéines en réponse à des forces. Cependant, les mécanismes moléculaires de la mécanosensibilité dans les cellules vivantes restent mal compris. En utilisant un dispositif d'étirement cellulaire compatible avec la microscopie de super-résolution (SRM) et le suivi de protéines individuelles (SPT), nous avons exploré les déformations et les réorganisations à l'échelle nanométrique des protéines au sein de structures mécano-sensibles. Nous avons réalisé des acquisitions de SRM sur des filaments intermédiaires, des microtubules et des sites d'adhésion intégrine-dépendant après étirement de cellules vivantes. Des experiences d'etirement cellulaire combinées au suivi de proteines individuelles ont montré que les intégrines suivent le déplacement élastique du substrat. Par contre, les filaments d'actine et la talin présentent également des réponses inélastiques différées et transitoires associées à un remodelage actif du cytosquelette actomyosine et à des déformations de la talin. La détection de la réorganisation des proteines à l'echelle moleculaire pendant l'étirement a montré que le recrutement de la vinculine force-dépendant est différé et dépend de l'état de maturation des sites d'adhésion intégrine-dépendant. Les résultats obtenus démontrent que la réponse mécanique des protéines n'est pas obligatoirement déclenchée par une transmission directe des forces externes. Au contraire, une contrainte mécanique externe déclenche une réponse active et déphasée de la cellule. Ce mécanisme amplifie les stimuli mécaniques faibles pour déformer ou recruter des protéines lors de la mécanosensibilité cellulaire. Nous avons ensuite adapté notre stratégie experimentale pour décrypter les mécanismes moléculaires de la mécanosensibilité dans les neurones. Dans le système nerveux, la mécanotransduction régule la sensation de douleur, le guidage axonal, la proprioception et les traumatismes cérébraux. Le squelette périodique membranaire (MPS), un réseau périodique sous-cortical d'actine et de spectrine, pourrait jouer un rôle mécanosensible dans les axones et les dendrites. Nous avons modifié notre dispositif d'étirement cellulaire pour le rendre compatible avec des cultures neuronales de plusieurs jours, afin d'étudier les réponses mécaniques des protéines composant le MPS par imagerie SRM/SPT.

Detection and conversion of mechanical forces into biochemical signals is known as mechanotransduction. From cells to tissues, mechanotransduction events regulate migration, proliferation and differentiation in physiological and pathological processes such as immune response, development and metastasis. Integrin adhesion sites (IAS) are mechanosensitive complexes structures essential for many of these processes, regulating cell adhesion, intracellular signaling and force transmission. Mechanosensing is based on protein deformations and reorganizations in response to force. However, the molecular mechanisms of mechanosensing in live cells remain poorly understood. Using a cell stretching device compatible with super-resolution microscopy (SRM) and single protein tracking (SPT), we explored the nanoscale deformations and reorganizations of individual proteins inside mechano-sensitive structures. We achieved SRM after live stretching on intermediate filaments, microtubules and integrin adhesion sites. Simultaneous SPT and stretching showed that while integrins follow the elastic deformation of the substrate, actin filaments and talin also displayed lagged and transient inelastic responses associated with active actomyosin remodeling and talin deformations. Capturing acute reorganizations of single-molecule during stretching showed that force-dependent vinculin recruitment is delayed and depends on the maturation state of integrin adhesions. Thus, cells respond to external forces by amplifying transiently and locally cytoskeleton displacements enabling protein deformation and recruitment in mechano-sensitive structures. We then adapted our strategy to decipher the molecular mechanisms of mechanosensing in neurons. In the nervous system, mechanotransduction regulates pain sensation, axonal guidance, proprioception, and brain trauma. The membrane periodic skeleton (MPS), a subcortical periodic actin-spectrin lattice, could have potential mechanosensitive roles in axons and dendrites. We modified our cell stretching device to enable long-term neuronal culture and stretching of neurons combined with SRM/SPT imaging of MPS proteins.