Imagerie super-résolue polarisée de l'orientation 3D de molécules uniques

Polarized super-resolution imaging of single molecules orientations in 3D

• Auteur / Autrice : Valentina Curcio
• Direction : Sophie Brasselet, Pascal Verdier-Pinard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique et sciences de la matière. Biophysique
• Date : Soutenance le 09/11/2020
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Physique et Sciences de la Matière (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Fresnel (Marseille, France) - AMOLF - HORIBA Jobin Yvon (France)
• Jury : Président / Présidente : Christophe Zimmer
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christophe Leterrier, Olivier Acher, Mossadek Talby
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Alexander Jesacher, Sandrine Lévêque-Fort

Mots clés

Mots clés contrôlés

Génie biomédical

Imagerie tridimensionnelle

Microscopie de polarisation

Microscopie de fluorescence

Microscopie

Cytosquelette

Biologie moléculaire

Biophysique

Mots clés libres

Polarisation

Microscopie

Super-Résolution

Cytosquelette

Orientation

Molécules uniques

Polarisation

Microscopy

Super-Resolution

Cytoskeleton

Single molecules

Orientation

Résumé

La microscopie de fluorescence polarisée permet l’étude de l’organisation de structures biologiques à l’échelle moléculaire: si les fluorophores sont rigidement liés aux protéines d’intérêt, leur orientation moyenne, fluctuation (wobbling) et localisation rendent compte de l'orientation et localisation de la protéine même. Souvent la mesure de l’orientation est limitée à sa projection 2D sur le plan de l’échantillon, source de biais dans la mesure du wobbling. J’ai analysé ces biais, et proposé une solution pour les réduire, en baissant l’ouverture numérique de détection, efficace par les résultats théoriques et expérimentaux obtenus. J’ai ensuite adressé la mesure de l’orientation et wobbling d’émetteurs fluorescents uniques en 3D: une première approche est basée sur la séparation du plan image en quatre projections de polarisation différentes. La sensibilité à l’orientation 3D est assurée par un filtrage d’intensité dans le plan focal arrière. En utilisant la démarche des problèmes inverses, on peut déterminer l’orientation 3D d’émetteurs uniques de manière compatible avec les techniques de super-résolution à molécule unique. Une autre approche, développée en collaboration avec M. Alonso, est basée sur la manipulation de phase et polarisation du plan focal arrière avec un élément optique à biréfringence spatialement variable. Les modifications de la forme des PSFs dépendent de manière non-ambiguë de l’orientation 3D, du wobbling et de la position en z, qui peuvent être mesurés en même temps. Nous avons appliqué ces techniques à l’étude des propriétés structurelles de filaments d’actine marqués en fluorescence et des fibres de stress d’actine en cellules fixées

Fluorescence polarization microscopy enables the study of biological structures organization at the molecular scale: if fluorophores are rigidly linked to the protein of interest, measuring their orientational behaviour (mean orientation and orientational wobbling), reports the orientational behaviour of the protein itself. The orientation retrieval is often limited to its 2D projection on the sample plane, source of biases in the retrieval of the molecular wobbling. I have analysed these biases, and proposed a way to reduce them by lowering the detection numerical aperture, valuable both from simulations and experimental results. I have then addressed the measurement of the full 3D orientational properties of single fluorophores: first, using an intensity-splitting approach of the image plane in four distinct polarization projections, the sensitivity to the 3D orientation is assured by intensity filtering in the back focal plane (BFP). Using an inverse problem approach, we can determine the 3D orientation, wobbling and 2D position of single fluorophores in a fast and robust way, compatible with single molecule super-resolution techniques. A second approach, developed in collaboration with M. Alonso, is based on the manipulation of phase and polarization in the BFP with a spatially-varying birefringent optical element. The modifications induced to the PSF shape depend in an unambiguous way on the 3D orientation and wobbling of single molecules, and on their z position, that can be measured at the same time. We applied both techniques to the study of structural properties of fluorescently labelled F-actin filaments and actin stress fibers in fixed cells