The SARS-CoV RNA polymerase : assembly, mechanism, and inhibition

par Nhung Thi Tuyet Le

Thèse de doctorat en Maladies infectieuses

Sous la direction de Bruno Canard.

Soutenue le 22-10-2020

à Aix-Marseille , dans le cadre de Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille) , en partenariat avec Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (AFMB) (Marseille) (laboratoire) .

Le président du jury était Bruno Coutard.

Le jury était composé de Nathalie Declerck.

Les rapporteurs étaient Olve Peersen, Eric J. Snijder.

mots clés

• .
• ARN polymérase ADN dépendante
• Exonucléases
• Virus à ARN
• Nucléotides
• Composés organiques volatils
• Covid-19

Titre traduit

Etudes des enzymes de réplication coronavirus : assemblage, mécanisme et inhibition

Résumé

Mon projet de doctorat décrit dans cette thèse était la caractérisation structurale et fonctionnelle de l'ARN polymérase du SARS-CoV complexe. Nous avons reconstitué un RTC hautement actif avec l’ARN polymérase dépendante de l’ARN nsp12 purifiée individuellement et son facteur de processivité nsp7-nsp8. En utilisant des analyses biochimiques, nous montrons que ce complexe de polymérase présente une faible fidélité sans l’aide de l’activité d’excision de l’Exonucléase (ExoN) de nsp14. Le SARS-CoV semble utiliser un mécanisme unique de correction de l’ARN impliquant le RdRp nsp12 et l’ExoN nsp14 qui n’a jamais été décrit dans aucun virus à ARN. Il montre également que ce complexe est capable de catalyser la formation de liaisons phosphodiester à un rythme plus rapide que tout autre RdRp viral connu à ce jour, ainsi qu’avec des taux d’erreur élevés pour l’incorporation du NTP, en particulier pour l’UTP. Le RTC du SARS-CoV incorpore facilement les 5’- triphosphates de Ribavirine, de 5-Fluorouracil et de de-fluoro Favipiravir-ribose dans l’ARN. Étant donné que l’exonucléase nsp14 est capable d’éliminer à la fois les mésappariements de l’extrémité 3’ et les analogues nucléotidiques, nos résultats suggèrent que les meilleures propriétés anti-SARS-CoV peuvent être obtenues avec des nucléotides mutagènes qui ne sont pas discriminés le site actif de nsp12. L’absence de traitement médicamenteux efficace contre les CoVs souligne la nécessité d’élucider leurs mécanismes de réplication et d’identifier des cibles médicamenteuses potentielles pour le traitement de l’infection par les CoVs. Notre résultat pourrait ouvrir la voie à la mise au point de nouveaux antiviraux contre ce virus.

mots clés

• .

Résumé

My PhD project described in this thesis was the structural and functional characterization of the SARS-CoV RNA polymerase complex.We first reconstitute a highly active RTC with individually purified RNA dependent RNA polymerase (RdRp) nsp12 and its processive factor nsp7-nsp8. By using biochemical assays, we show that this polymerase complex exhibits low fidelity without the help of Exonuclease (ExoN) excision activity of nsp14. SARS-CoV seems to use a unique RNA proofreading mechanism involving the RdRp nsp12 and the ExoN nsp14 that has never been described in any RNA virus. It also shows that this complex is able to catalyze phosphodiester bond formation at a faster rate than any other viral RdRp known so far, as well as with high error rates for NTP incorporation, in particular for UTP. The SARS- CoV RTC readily incorporates 5’-triphosphates of Ribavirin, 5-Fluorouracil, and de-fluoro Favipiravir-ribose into RNA. Since the nsp14 exonuclease is able to remove both 3’- terminus mismatches and nucleotide analogues, our results suggest that best anti-SARS-CoV properties may be achieved with mutagenic nucleotides that are not discriminated at the nsp12 active-site.The lack of effective drug treatment against CoVs highlights the need for elucidating their replication mechanisms and identifying potential drug targets for treatment of CoVs infection. Our result may pave the way to develop new antivirals against this virus.