Contrôle génétique de la morphogenèse bactérienne

Genetic control of bacterial morphogenesis

• Auteur / Autrice : Antoine Vigouroux
• Direction : David Bikard, Sven van Teeffelen
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biophysique
• Date : Soutenance le 27/05/2019
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Frontières de l'innovation en recherche et éducation (Paris ; 2006-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Descartes (1970-2019)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie de synthèse
• Jury : Président / Présidente : Ivan Matic
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Ivan Matic, Johannes Hohlbein, Meriem El Karoui, Lydia Robert, Olivier Tenaillon
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Johannes Hohlbein, Meriem El Karoui

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biométrie

Morphogenèse

Mots clés libres

CRISPR

Morphogenèse

Peptidoglycane

Biologie quantitative

CRISPR

Morphogenesis

Peptidoglycan

Quantitative biology

Résumé

Depuis la découverte de l'ADN, notre compréhension de la morphogénèse bactérienne a beaucoup progressé mais aussi donné lieu à de nouvelles questions. La bactérie Escherichia coli est capable de maintenir une forme de bâtonnet de façon robuste, mais son génome ne contient aucun de plan de construction précis. La forme des cellules est déterminée dynamiquement par les enzymes qui synthétisent la paroi cellulaire, un polymère rigide qui entoure la cellule. Pour étudier quantitativement comment la biogénèse de la paroi et la forme des cellules dépend des concentrations des enzymes essentielles, nous utilisons un dérivé sans activité nucléase de CRISPR/Cas9 pour bloquer partiellement la transcription. Cette méthode n'ayant pas été utilisée avant, nous avons étudié ses propriétés en détail sur des rapporteurs fluorescents. Cela nous a conduit à des découvertes surprenantes: on considérait auparavant que la répression dépendait de la fréquence de fixation de dCas9 à sa cible. Nous avons démontré un mécanisme différent: la complémentarité guide/cible détermine la probabilité que la RNA polymérase déplace activement dCas9 lors de la transcription. Cela conduit à des propriétés désirables: la force de répression ne dépend pas du niveau d'expression natif de la cible, et n'ajoute pas de bruit extrinsèque à l'expression. Cela est maintenant publié dans Molecular Systems Biology. Armés de cet outil, nous avons pour objectif de comprendre globalement comment les différents composants de la machinerie de synthèse de la paroi cellulaire sont articulés entre eux. Pour polymériser la paroi cellulaire, qui donne sa forme à la cellule, deux groupes d'enzymes ont été décrits: le complexe Rod et les PBP de classe A. Nous avons créé des souches exprimant ces deux catégories d'enzymes à des niveaux variables et caractérisé leurs phénotypes par différents moyens biophysiques (résistance mécanique, diffusion de molécules uniques, sensibilité à des antibiotiques...). Nous avons pu mettre en évidence que des enzymes avec des activités biochimiques similaires peuvent provoquer des réponses complètement différentes lorsque leurs niveaux sont changés. Ces travaux ont permis de mieux comprendre comment ces différents mécanismes sont coordonnés pour maintenir l'intégrité de la paroi à de multiples échelles.

Since the discovery of DNA, our understanding of the morphogenesis of bacterial cells has made great advance and also gave rise to new questions. Even though the bacterium Escherichia coli is able to maintain rod shape robustly, the genome does not encode any internal blueprint of what the cell should look like. Rather, cell shape is dynamically determined by the enzymes synthesizing the cell-wall, a rigid polymer that surrounds the cell. To quantitatively study the dependence of cell-wall biogenesis and cell shape on levels of essential cell-wall synthesis proteins, we use a nuclease-deficient CRISPR/Cas9 to partially block transcription. As this method had no been put into practice before, we thoroughly investigated its properties on a model system using fluorescent reporters. This led us to surprising findings: it was previously assumed that decreased levels of guide RNA complementarity would decrease repression strength by virtue of reduced occupancy of the target. We demonstrated a different mechanism: complementarity determines the probability that RNA polymerase kicks out dCas9 during the transcription attempt, while the rate of spontaneous dCas9 unbinding is negligibly small. If dCas9 levels are high enough to saturate the target this mechanism alone determines repression strength. This leads to desirable properties: First, relative repression strength is independent of native expression levels. Second, repression does not add any extrinsic noise to gene expression. These findings are now published in Molecular Systems Biology. Armed with this tool, we aim get a global understanding of the interplay between the different components of the cell-wall machinery. To polymerize the cell wall , which gives its shape to the cell, two groups of enzymes were described: the Rod Complex and class A PBPs. We created strains expressing this two categories of enzyme at variable levels, then characterized their phenotypes by different biophysical means (mechanical resistance, single-molecule diffusion, antibiotic sensitivity...). This way, we could show that enzymes that share similar biochemical activities can elicit very different responses when their levels are changed. This work allowed to better understand how these different mechanisms are coordinated to maintain cell wall integrity at multiple scales.