Conséquences fonctionnelles des mutations du gène SF3B1 dans les syndromes myélodysplasiques avec sidéroblastes en couronne

Functional consequences of SF3B1 mutations in myelodysplastic syndromes with ring sideroblasts

• Auteur / Autrice : Sabrina Bondu
• Direction : Michaëla Fontenay
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Hématologie et oncologie
• Date : Soutenance le 28/02/2019
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Hématologie, oncogenèse et biothérapies (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Descartes (1970-2019)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Cochin / IC UM3 (UMR 8104 / U1016)
• Jury : Président / Présidente : Sophie Vaulont
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Michaëla Fontenay, Sophie Vaulont, Sarah Lambert, Marie-Bérengère Blanc-Troadec, Marc-Henri Stern, Jean-Baptiste Micol
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sarah Lambert, Marie-Bérengère Blanc-Troadec

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mutation (biologie)

Cellules souches hématopoïétiques

Syndrome myélodysplasique

Mots clés libres

SMD-SC

SF3B1

Épissage

Érythroferrone

Réplication et réparation de l’ADN

MDS-RS

SF3B1

Splicing

Erythroferrone

DNA replication and DNA repair

Résumé

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) avec sidéroblastes en couronne (SMD-SC) sont des pathologies clonales de la cellule souche hématopoïétique caractérisées par une érythropoïèse inefficace et une surcharge mitochondriale et systémique en fer. Le gène SF3B1 est muté chez 90% des patients porteurs d’un SMD-SC. Il code pour un facteur d’épissage appartenant au complexe U2 du spliceosome. L’interaction de SF3B1 avec l’intron au niveau du site de branchement permet le recrutement d’U2. SF3B1 s’associe aussi avec la chromatine et sa dynamique de distribution dans le noyau est sous le contrôle de diverses protéines de réparation de l’ADN, telles FANCD2, FANCI, et BRCA1. Les conséquences fonctionnelles des mutations du gène SF3B1 (SF3B1MUT) dans les SMD-SC sont mal connues. Lors de ma thèse, je me suis intéressée aux anomalies d’épissage générées en aval des mutations de SF3B1 dans les cellules des patients porteurs d’un SMD. En accord avec les précédentes analyses de séquençage de l’ARN dans les pathologies SF3B1MUT, les mutations de SF3B1 sont associées à une utilisation préférentielle de sites accepteurs alternatifs dans les cellules mononucléées (CMN) de SMD. Nous avons identifié la surexpression d’un transcrit alternatif de l’érythroferrone (ERFE) dans les CMN et érythroblastes en culture SF3B1MUT. ERFE est une hormone sécrétée par les érythroblastes qui régule l’expression hépatique de l’hepcidine, cette dernière limitant la biodisponibilité du fer dans le plasma. Le transcrit alternatif d’ERFE (ERFE+12) n’est retrouvé que dans les cellules érythroïdes SF3B1MUT et son expression reflète l’érythropoïèse clonale induite par les mutations de SF3B1. ERFE+12 est traduit en un variant protéique fonctionnel. L’augmentation des concentrations des protéines ERFE canonique et alternative dans le plasma des patients SMD SF3B1MUT est corrélée à la diminution des taux d’hepcidine, et explique le développement précoce d’une surcharge systémique en fer. J’ai ensuite caractérisé les processus de réplication et de réparation de l’ADN dans les érythroblastes primaires humains SF3B1MUT et dans la lignée érythroïde murine G1E-ER4 CRISPR-Cas9 Sf3b1K700E. Nos expériences démontrent que les mutations de SF3B1 confèrent un avantage de prolifération aux précurseurs érythroïdes immatures en augmentant leur dynamique de réplication de l’ADN, via l’accélération de la progression des fourches. L’augmentation de la vitesse des fourches de réplication s’accompagne d’une exposition d’ADN simple-brin recouvert par la protéine p-RPA32, mais ne conduit pas à la formation de cassures double-brin de l’ADN. Les mutations de SF3B1 contribuent donc à accroître de façon inadéquate le compartiment des cellules érythroïdes immatures dans la moelle osseuse des patients SMD-SC. Nos prochains travaux viseront à déterminer par quels mécanismes les fourches de réplication sont accélérées, notamment avec l’exploration des intermédiaires de transcription R-loops.

Myelodysplastic syndromes with ring sideroblasts (MDS-RS) are clonal hematopoietic stem cell (HSC) disorders characterized by anemia, bone marrow (BM) erythroid dysplasia and systemic iron accumulation. Mitochondrial iron accumulation and apoptosis of mature erythroblasts cause ineffective erythropoiesis. Splicing factor gene SF3B1 is mutated in ~90% of MDS-RS. SF3B1 mediates U2 snRNP recruitment to the branch point (BP) by interacting with the intronic RNA on both sides of the BP. SF3B1 also interacts with nucleosomes located at exonic positions. The nuclear dynamics of SF3B1 is under the control of Fanconi anemia FANCD2 and FANCI proteins, suggesting coordination between DNA repair pathway and cotranscriptional splicing during S phase. In response to DNA damage, the BRCA1/SF3B1 complex facilitates the splicing of DNA repair genes. Functional consequences of SF3B1 mutations in MDS-RS are still unknown. We first assessed the consequences of SF3B1 gene mutations on gene expression and splicing by sequencing the transcriptome of the BM mononuclear cells (MNC). SF3B1 hotspot mutations induce cryptic 3’ splice site selection through use of a different BP, as previous studies in MDS and other SF3B1-driven cancers have already shown. We identified an alternative transcript of erythroferrone (ERFE) in MNC of MDS patients with SF3B1 mutation. ERFE has recently been described as a major erythroid regulator of hepcidin, a key hormone that is involved in the control of iron homeostasis in the body. The expression of the variant ERFE transcript was restricted to SF3B1-mutated erythroblasts and allows the monitoring of clonal erythropoiesis. ERFE neo-isoform (ERFE+12) accounts for an overall increase of ERFE expression in SF3B1MUT MDS. ERFE+12 is translated into a functional variant protein in SF3B1MUT erythroblasts. Plasma concentrations of both canonical and aberrant ERFE proteins are significantly more elevated in SF3B1MUT MDS compared to SF3B1WT MDS and inversely correlated to hepcidin/ferritin ratio. Thus, we identified a SF3B1-dependent and erythroid cell intrinsic mechanism of hyperferritinemia in MDS-RS. We next analysed the DNA replication and DNA repair processes in human SF3B1MUT primary erythroblasts and in murine CRISPR-Cas9 Sf3b1K700E G1E-ER4 proerythroblastic cell line. We confirmed that SF3B1MUT erythroblasts have an increased proliferation rate, but they enter into terminal erythroid differentiation more rapidly than healthy controls or SF3B1WT MDS. We reported an increased DNA replication dynamics, since the rate of DNA fiber elongation is accelerated in Sf3b1K700E G1E-ER4 cells. It has recently been suggested that high speed of fork progression induces DNA replication stress. Consistently, we observed the spontaneous accumulation of single-stranded DNA covered by replication protein A in actively dividing SF3B1MUT proerythroblast and basophilic erythroblasts. No DNA-double strand break and no fork collapse were observed in SF3B1MUT cells. Thus, SF3B1 mutations induce a replication stress without stalling forks and contribute to the development of a clonal erythropoiesis. Mechanistically, we hypothesize that replication forks encounter less obstacles in SF3B1-mutated compared to SF3B1-wildtype erythroblasts. To address this point, we will investigate the presence of R-loops at the promoter regions of selected genes.