Etude des mécanismes impliqués dans l'atténuation des Flavivirus neurotropes : la protéine de membrane comme cible de l'atténuation

Study of the mechanisms involved in neuropathogenic Flavivirus attenuation : the membrane protein as a target for viral attenuation

• Auteur / Autrice : Justine Basset
• Direction : Nathalie Pardigon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie. Virologie
• Date : Soutenance le 04/12/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de Recherche et d'Expertise Environnement et risques infectieux (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Sylvie Van der Werf
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nathalie Pardigon, Sylvie Van der Werf, Sylvie Lecollinet, Alain Kohl, Stéphane Blanc, Jean Dubuisson, Nolwenn Jouvenet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sylvie Lecollinet, Alain Kohl

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mutagenèse dirigée

Protéines de la matrice virale

sécrétion

Virus du Nil occidental

virologie

Infections à flavivirus

Virus -- Atténuation

Mots clés libres

Morphologie virale

Flavivirus

West Nile virus

Membrane protein

Morphology

Secretion

Attenuation

Mutagenesis

Résumé

En raison de leur potentiel élevé de transmission, de leur vitesse de dissémination qui peut être fulgurante et des maladies parfois sévères qu’ils induisent, les Flavivirus sont considérablement préoccupants. Le virus West Nile (WNV) est actuellement l'un des arbovirus (arthropod-borne virus)le plus répandu dans le monde et sa forte capacité de (ré)émergence pose un problème de santé publique important. Ce virus est responsable de nombreux cas de maladies neurologiques sévères, parfois mortelles, notamment chez l’Homme et les chevaux. Aucun traitement ou vaccin humain anti-WNV n’est actuellement disponible sur le marché. Le(s) rôle(s) de la protéine de membrane (M) des Flavivirus est/sont encore peu caractérisé(s). Cette glycoprotéine est ancrée dans la membrane virale et joue un rôle structural important dans les processus de fusion et de maturation des particules virales. De plus, la protéine M a récemment été associée à la pathogénèse induite par les virus de l’encéphalite japonaise et du Zika (de Wispelaere et al., 2016; Yuanet al., 2017), suggérant que cette protéine contient des déterminants viraux essentiels à la virulence. Afin d’étudier les mécanismes sous-jacents, nous avons substitué le résidu isoleucine localisé en position 36de l’ectodomaine de la protéine M par une phénylalanine (M-I36F), et démontré que cette mutation provoque un encombrement allostérique qui affecte directement la structure de la protéine M.L’introduction d’une seconde mutation (substitution de l’alanine en position 43 par une glycine, résidu ne possédant pas de chaine latérale) dans la même protéine nous a permis de stabiliser la mutation MI36F. Si la mutation M-I36F seule ou associée à la mutation M-A43G n’affecte pas les étapes précoces (entrée,traduction, réplication) du cycle viral, elle est cependant à l’origine d’une modification de la morphologie des particules virales chez l’hôte mammifère. De plus, notre étude suggère que la sécrétion des particules de WNV néo-formées hors du réticulum endoplasmique, une étape encore peu caractérisée du cycle viral, dépend directement de leur morphologie. Enfin, cette étude nous a permis de mettre au point un modèle d’atténuation du WNV rationnellement dessiné, qui a été testé in vivo dans un modèle murin décrit d’encéphalite induite par le WNV. La protection complète induite par le virus double mutant, que nous observons lors d’une épreuve létale avec le virus sauvage, fait de ce virus mutant un potentiel candidat vaccin. Cette étude fait l’objet d’un dépôt de brevet.

Because of their highly transmission potential, their speed of dissemination that can be dazzling, and the disease severity they might induced, flaviviruses are of great concern. West Nile virus (WNV) is currently one of the most common arboviruses (arthropod-borne virus) in the world and its high ability to (re-)emerge causes a global public health problem. This virus is responsible for many cases of severe neurological diseases, sometimes fatal, especially in humans and horses. No human anti-WNV treatment or vaccine is currently available. The role(s) of the Flavivirus membrane protein (M) is/are still poorly characterized. This glycoprotein is anchored in the viral membrane and plays an important structural role in the processes of fusion and maturation of viral particles. In addition, the M protein has recently been associated with Japanese Encephalitis and Zika-induced pathogenesis (de Wispelaere et al., 2016; Yuan et al., 2017), suggesting that this protein contains viral determinants essential for virulence. In order to study the underlying mechanisms, we substituted the isoleucine residue located in position 36 of the ectodomain of the M protein with a phenylalanine (M-I36F), and demonstrated that this mutation causes a steric hindrance that directly affects the structure of the M protein. The introduction of a second mutation (substitution of the alanine residue at position 43 with a glycine which has no side chain) in the same protein allowed stabilization of the M-I36F mutation. If the M-I36F mutation alone or associated with the M-A43G mutation does not affect the early stages (entry, translation, replication) of the viral cycle, it is however at the origin of a change in the morphology of viral particles in the mammalian host. In addition, our study strongly suggests that the secretion of newly formed WNV particles from the endoplasmic reticulum, a still poorly described stage of the viral cycle, directly depends on their morphology. Finally, this study allowed us to develop a rationally designed WNV attenuation model, which was tested in vivo in a previously described mouse model of WNV-induced encephalitis. The complete protection against a lethal challenge with the wild-type virus of mice previously infected with the double mutant virus makes this mutant virus a potential candidate vaccine. This study is being filed for a patent application.