Rôle de la protéine HBc du virus de l'hépatite B sur la biologie des ARN viraux

Role of Hepatitis B virus core protein on HBV RNA transcription and stability

• Auteur / Autrice : Barbara Quioc-Salomon
• Direction : Christine Neuveut
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Virologie
• Date : Soutenance le 20/09/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de Virologie moléculaire et Vaccinologie (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Sylvie Van der Werf
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Florence Margottin-Goguet, Monsef Benkirane
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Henri Gruffat, David Durantel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Stabilité de l'ARN

Protéines de capside

Antigène HBc

ARN viral

Carcinome hépatocellulaire

Virus de l'hépatite B

Mots clés libres

ADN circulaire fermé de façon covalente (ADNccc)

Covalently closed circular DNA (cccDNA)

Résumé

Les patients infectés chroniquement par le VHB ont un risque élevé de développer des maladies graves du foie telles que le carcinome hépatocellulaire. Dans les cellules infectées, le virus persiste sous la forme d’un ADN circulaire covalemment clos (ADNccc) qui reste stable même chez les patients qui suivent un traitement. La protéine virale HBc, en plus de son rôle dans la formation des capsides, est retrouvée dans le noyau et est recrutée sur l’ADNccc et modifie sa structure. Cependant son rôle dans ce contexte n’est pas encore compris. Afin de mieux comprendre le rôle nucléaire d’HBc notamment sur la biologie de l’ADNccc et l’expression des ARN viraux, nous avons construit plusieurs mutants déficients pour l’expression d’HBc. Nous avons tout d’abord construit un mutant qui possède deux codons stop après le codon 27 d’HBc suivi d’une substitution d’une partie du gène HBc par une séquence codant différents épitopes. Lors de l’infection, ce virus possède un fort défaut d’expression des ARN viraux, qui ne peut être restauré par la ré-expression d’HBc. La quantification des ARN naissants montre que le défaut semble être post-transcriptionnel mais est présent rapidement après la transcription (<2h). Ces résultats suggèrent que le défaut observé est indépendant d’HBc et que la séquence délétée de HBV HBc-Flag27* pourrait être impliquée dans un mécanisme de régulation post-transcriptionnelle. Grâce à ce virus, nous avons pu mettre en évidence que la protéine HBc apportée avec la capside lors de l’infection est capable de se réassocier sur l’ADNccc dans le noyau. Nous avons ensuite étudié des mutants ayant une séquence plus proche de la souche sauvage, sans cette substitution. Lorsqu’ils sont exprimés à partir d’un plasmide exprimant à la fois le génome et la protéine HBc sous le contrôle d’un promoteur SV40, nous observons un défaut d’expression de l’ARNpg pour des mutants possédant les codons stop après le 27e ou le 38e codon du gène HBc, mais pas lorsqu’il est placé après le 67e codon. Ces résultats suggèrent que le déplacement du codon stop d’HBc induit la diminution de l’expression de l’ARNpg et que le codon stop naturel d’HBc pourrait être protégé des voies de surveillance des ARN viraux comme la nonsense-mediated decay (NMD) qui reconnait les ARN ayant un codon stop prématuré. Lors des infections par ces virus, et donc en absence d’HBc, nous observons un défaut accru pour les virus ayant des codons stop aux codons 27 et 38 et un défaut apparait pour le virus ayant le codon stop après la position 67. Dans ce contexte, en absence d’HBc, nous avons pu voir que les ARN codants pour les protéines de surface sont également impactés et que l’expression des ARN peut être partiellement restaurée par l’expression d’HBc. Par des techniques de chromosome conformation capture nous avons pu mettre en évidence que le virus HBV HBc-27* n’est plus exclu des régions réprimées contactant des lamines, indiquant que la protéine HBc pourrait être impliquée dans la l’adressage de l’ADNccc vers des régions favorables pour la transcription. Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans la régulation par HBc, nous avons isolé les partenaires nucléaires de la protéine et mis en évidence de nombreux facteurs impliqués dans la régulation de l’ADN et de la transcription ainsi que dans la réparation des dommages à l’ADN.Dans l’ensemble, nos résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes de régulation de la biologie des ARN du VHB.

Chronic HBV carriers (CHB) are at high risk of developing hepatocellular carcinoma. Because covalently closed circular DNA (cccDNA) persists in infected cells through RNA expression, deciphering the mechanisms involved in RNA transcription and stability is a crucial step to identify new antiviral targets. In addition to its role in capsid formation, HBV core protein (HBc) has been shown to be associated with the cccDNA and to modulate its structure, yet the impact of this modification on HBV transcription is not fully understood. To better understand the role of HBc in this context we constructed several mutants deficient for HBc expression. The first mutant has two stop codons after codon 27 in HBc followed by a substitution of the HBc sequence by a sequence encoding different epitopes. During infection, this virus shows a strong decrease in expression of viral RNA, which cannot be rescued by re-expression of HBc. The quantification of nascent RNAs shows that the defect appears to be post-transcriptional and is present as early as 2h after transcription. These results suggest that the observed defect is independent of HBc and that the deleted sequence in the HBV genome of this mutant could be involved in a post-transcriptional regulatory mechanism. With this mutant, we have been able to demonstrate that the HBc protein provided by the capsid during infection is able to re-associate onto the cccDNA in the nucleus. We then studied HBc mutants generated in the context of the the wild-type virus sequence, without the substitution. When expressed from a plasmid expressing both the genome and the HBc protein under the control of SV40 promoter, we observe a decrease of the pgRNA expression for mutants having the stop codons after the 27th or 38th codon of HBc, but not when the stop codon is located after the 67th codon. These results suggest that displacement of the HBc stop codon induces a decrease in pgRNA expression, independently of HBc protein, and that the natural stop codon of HBc could be protected from viral RNA surveillance pathways such as nonsense-mediated decay (NMD) that recognizes RNAs with a premature stop codon. During infections with these viruses, and therefore in the absence of HBc, we observed an increased in the defect for viruses having stop codons at position 27 and 38 and a defect appears for a virus having the stop codon at position 67. In this context, in the absence of HBc, we have seen that RNAs encoding surface proteins are also impacted and that RNA expression can be partially restored by HBc expression. By chromosome conformation capture techniques we were able to observe that the HBc-27* HBV virus is no longer excluded from repressed regions associated with lamins, indicating that the HBc protein could be involved in the localization of the cccDNA at active chromatin regions favorable for transcription.In order to understand the mechanisms involved in HBc regulation, we have isolated the nuclear partners of HBc and highlighted many factors involved in the RNA and DNA regulation, in the DNA damage repair and RNA processing.Overall, our results shed light on the regulatory mechanisms of HBV RNA biology.