Imagerie confocale rapide de fluorescence chez la souris libre de se mouvoir et application à l'enregistrement de l'activité neuronale dans l'hippocampe

Fast confocal fluorescence imaging in freely-behaving mice with a fiberscope

• Auteur / Autrice : Clara Dussaux
• Direction : Cathie Ventalon, Laurent Bourdieu
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences et troubles neuronaux
• Date : Soutenance le 08/11/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Frontières de l'innovation en recherche et éducation (Paris ; 2006-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie de l'École normale supérieure (Paris ; 2010-....)
• Jury : Président / Présidente : Georges Debrégeas
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Georges Debrégeas, Tommaso Fellin, Alexandra Fragola, Desdemona Fricker, Karim Benchenane
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Tommaso Fellin, Alexandra Fragola

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microscopie confocale

imagerie diagnostique

Cortex cérébral

méthodes

Technologie des fibres optiques

Mémoire spatiale

Mots clés libres

Fibroscopie

Imagerie calcique

Souris non contrainte

Neurosciences

Hippocampe

Navigation

Confocal microscopy

Fiberscope

Calcium Imaging

Freely-Moving

Neuroscience

Hippocampus

Spatial navigation

Résumé

L'un des objectifs des neurosciences est de comprendre comment l'activité neuronale est liée aux comportements et à la cognition. Cependant, comprendre les mécanismes neuronaux induits par une stimulation sensorielle ou par l'engagement dans une tâche comportementale nécessite idéalement d'étudier l'activité neuronale dans le cerveau intact, chez l'animal éveillé et libre de se mouvoir. Le développement actuel d'outils optogénétiques permettant d'observer et de manipuler l'activité des neurones au moyen de la lumière, tout en ciblant spécifiquement des types cellulaires a été une avancée majeure et permet aujourd'hui d'aborder ces questions, à condition de disposer d'outils de microscopie permettant d'observer (ou de manipuler) de larges populations de neurones avec une résolution spatio-temporelle suffisante pour enregistrer (ou reproduire) l'activité neuronale des cellules individuelles chez l'animal libre de se mouvoir. Nous avons choisi de développer une approche par fibroscopie (microscope couplé à l'animal par un guide d'image au bout duquel est attaché un micro-objectif) et d'utiliser une approche de microscopie confocale, qui est une technique d'imagerie à sectionnement optique, c'est à dire pour laquelle le signal provenant de plans hors focus n'est pas enregistré, améliorant considérablement la qualité de l'image par apport à de la microscopie plein champ conventionnelle. Afin de pallier la cadence d'acquisition relativement faible d'un microscope confocale classique (liée au balayage 2D du point d'illumination dans l'échantillon), tout en préservant le rapport signal sur bruit, nous avons multiplexé l'acquisition : ou bien plusieurs points sont illuminés simultanément (comme dans la technique de microscopie confocale à disque rotatif, ou spinning disk), ou bien une ligne entière est illuminée. L'intensité de fluorescence est collectée sur une caméra, après transmission par un masque de détection similaire au masque d'illumination. Ces motifs d'illumination et les masques de détection sont ensuite balayés de façon à former une image. Dans notre cas, les masques d'illumination sont créés au moyen d'un DMD (matrice de micro-mirroirs), dont le taux de rafraichissement élevé (16 kHz) permet d'atteindre des cadences d'imagerie de plusieurs centaines de Hz. Les masques de détection sont créés soit par le DMD, soit directement par la caméra. Nous avons également implémenté une technique hybride consistant à enregistrer simultanément une image confocale multipoint et une image de microscopie plein champ conventionnelle afin de soustraire le signal hors-focus résiduel dans l'image confocale (differential multipoint scan). Ce système est miniaturisé pour pouvoir être porté par une souris en comportement libre (<2g), adapté à l'imagerie chronique, compatible avec de la photoactivation ciblée, présente une résolution cellulaire et permet d'imager à plus de 100Hz. Nous avons dans un premier temps caractérisé théoriquement et expérimentalement les performances optiques de ces trois implémentations (plein champ, line scan et multipoint scan) en termes de résolution spatiale, cadence d'imagerie, rapport signal sur bruit, réjection du signal hors-focus. Dans un second temps, nous avons réalisé des expériences d'imagerie calcique dans l'hippocampe où se situent les cellules de lieu, qui ont la propriété d'être actives spécifiquement lorsque l'animal se trouve dans un endroit particulier, pendant que la souris exécutait une tâche de navigation spatiale consistant à effectuer des aller retours sur un chemin linéaire, et ce, au cours de sessions > 1h, sur plusieurs semaines, sans photoblanchiement ni photodommage. Le fibroscope embarque également un module de photoactivation ciblée par modulation d'intensité et pourra être utilisé, en l'état de développement actuel, pour étudier le codage de la mémoire spatiale dans l'hippocampe.

One of the goals of neuroscience is to understand how neural activity is related to behavior and cognition. However, understanding the neural mechanisms induced by sensory stimuli or the engagement in a behavioral task ideally requires studying the neuronal activity in the intact brain, in the awake and freely-moving animal. The current development of optogenetic tools to observe and manipulate neuronal activity with light, while specifically targeting cell types, has been a major breakthrough and now allows us to address these issues, provided that microscopic tools are also available to observe (or manipulate) large populations of neurons with a sufficient spatio-temporal resolution to record (or reproduce) the neuronal activity of individual cells in the freely-behaving animal. We chose to develop a fiberscope (a microscope coupled to the animal by an image guide with a micro-objective attached to it) and to use a confocal microscopy approach, which is an optical sectioning imaging technique, ie for which the signal from out-of-focus planes is not recorded, greatly improving image quality as compared to conventional widefield microscopy. In order to overcome the relatively low acquisition rate of a conventional confocal microscope (related to the 2D scanning of the illumination point in the sample), while preserving the signal-to-noise ratio, we have multiplexed the acquisition: either several points are illuminated simultaneously (as in the spinning-disk confocal microscopy technique), or an entire line is illuminated. The fluorescence intensity is collected on a camera, after transmission by a detection mask similar to the illumination mask. These illumination patterns and the detection masks are then scanned to form an image. In our case, the illumination masks are created using a DMD (matrix of micro-mirrors), whose high refreshing rate (16 kHz) can achieve imaging rates of several hundred Hz. The detection masks are created either by the DMD or directly by the camera. We have also implemented a hybrid technique in which we record simultaneously a multipoint confocal image and a conventional widefield image to subtract the residual out-of-focus signal in the confocal image (differential multipoint scan). This system is miniaturized to be carried by a freely-behaving mouse (< 2g), adapted to chronic imaging, compatible with targeted photoactivation, has a cellular resolution and can image at more than 100Hz. We first characterized theoretically and experimentally the optical performances of these three implementations (widefield, line scan and multipoint scan) in terms of spatial resolution, imaging rate, signal-to-noise ratio, rejection of the out-of-focus signal. In a second step, we performed calcium imaging experiments in the hippocampus where place cells are located, which have the property of being active specifically when the animal is in a particular place, while the mouse performed a spatial navigation task consisting of going back and forth on a linear track, during sessions > 1h, over several weeks, without photobleaching or photodamage. The fiberscope also embeds a targeted photoactivation module by intensity modulation and can be used, in the current state of development, to study spatial memory coding in the hippocampus.