Intérêt thérapeutique de nanoparticules d'oxyde de cérium innovantes pour l'ischémie cérébrale

Innovative cerium oxide nanoparticles for cerebral ischemia

• Auteur / Autrice : Geoffroy Goujon
• Direction : Isabelle Margaill
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacologie
• Date : Soutenance le 22/10/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Innovations Thérapeutiques en hÉMostase (Paris ; 2006-....)
• Jury : Président / Présidente : Armelle Baeza-Squiban
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Armelle Baeza-Squiban, Vincent Bérézowski, Hervé Hillaireau, Sébastien Faure, Virginie Beray-Berthat
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Vincent Bérézowski, Hervé Hillaireau

Mots clés

Mots clés contrôlés

Maladies cérébrovasculaires

Cerveau

Cellules endothéliales

Stress oxydatif

Nanoparticules

Oxydes de cérium

Ischémie cérébrale

Mots clés libres

Ischémie cérébrale

Nanoparticules d'oxyde de cérium

Stress oxydant

Cellules endothéliales cérébrales (bEnd3)

Ischemic stroke

Cerium oxide nanoparticles

Oxidative stress

Cerebral endothelial cells (bEnd3)

Résumé

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) constituent la 2ème cause de mortalité dans le monde et la 1ère chez les femmes en France. Pour les AVC ischémiques (AVCi), seules des stratégies de recanalisation pharmacologique ou mécanique ont été approuvées mais aucune stratégie protectrice n'est aujourd'hui disponible. Bien que le rôle délétère du stress oxydant ait été clairement établi dans les lésions neuronales et vasculaires à la suite d'une ischémie cérébrale (IC) dans les études précliniques, aucune stratégie anti-oxydante n'a démontré d'efficacité clinique à ce jour. Or, les nanoparticules d'oxyde de cérium (NPC) possèdent de multiples capacités antioxydantes (enzymatique et non enzymatique). Afin d'améliorer la biocompatibilité des NPC, la société Specific Polymers® a développé des copolymères de polyéthylène glycol (PEG)/ polyméthacrylate de méthyle/ phosphonate pour recouvrir leur surface. De plus, ces polymères peuvent être fonctionnalisés avec un peptide ciblant l'endothélium ce qui permettrait d'y concentrer l'effet antioxydant des NPC, afin de réduire la survenue d'hémorragies cérébrales, complications graves chez les patients victimes d'AVCi. L'objectif de cette thèse est d'évaluer l'impact du recouvrement des NPC sur leur potentiel thérapeutique dans l'IC. Les études ont été menées in vitro pour établir la toxicité, l'effet antioxydant et l'internalisation cellulaire des NPC et in vivo, pour examiner leur biodistribution et leur toxicité, ainsi que leur potentiel thérapeutique dans un modèle d'IC. Les études in vitro ont été effectuées sur des cellules endothéliales cérébrales murines de la lignée b.End3. Nous avons démontré que les NPC n'induisaient ni mortalité, ni perturbation de l'activité métabolique jusqu'à 100µg/ml. A 1000µg/mL, les NPC nues augmentent la mortalité, contrairement aux NPC PEGylées. Nous avons modélisé l'excitotoxicité survenant lors d'une IC et qui contribue au stress oxydant, grâce à un traitement des cellules par le glutamate. L'augmentation de la production d'espèces réactives de l'oxygène par les cellules b.End3 et l'oxydation des acides nucléiques dans ces conditions ont été réduites par les NPC, démontrant que leur recouvrement n'interfère pas avec leurs propriétés anti-oxydantes. La fonctionnalisation des NPC a permis le greffage d'un fluorophore pour suivre leur internalisation par cytométrie en flux et microscopie confocale. Nous avons ainsi mis en évidence que les NPC étaient rapidement internalisées dans les cellules b.End3. Des études de microscopie électronique ont ensuite montré que les NPC sont principalement localisées dans des endosomes périnucléaires. Enfin, nous avons réalisé le greffage sur les NPC d'un peptide ciblant une protéine d'adhésion vasculaire surexprimée lors de l'IC. La suite de ces études consistera à vérifier l'interaction spécifique de ces NPC avec la molécule d'adhésion. Les études in vivo ont permis d'établir la biodistribution des NPC chez des souris Swiss : des NPC sont retrouvées durant les premières heures suivant leur injection, avant leur élimination par voie rénale. L'histopathologie n'a révélé aucune toxicité des NPC sur le foie, les reins, la rate, les poumons et le cerveau de ces souris et aucune modification de leur numération sanguine n'a été observée. Les NPC ont ensuite été administrées dans un modèle murin d'IC, mais n'ont pas réduit le volume de la lésion dans nos conditions. En conclusion, le recouvrement des NPC par des polymères innovants a réduit leur toxicité sans altérer leurs capacités antioxydantes et leur internalisation dans des cellules endothéliales cérébrales. L'absence d'accumulation à long terme et de toxicité in vivo sont encourageantes quant à leur biocompatibilité. Bien que les NPC n'aient pas montré d'effet protecteur in vivo, celles ciblant l'endothélium pourraient réduire les lésions vasculaires et le risque hémorragique consécutif à une IC.

Stroke is the second leading cause of death in the world and the first cause of death among women in France. For ischemic stroke, only pharmacological or mechanical recanalization strategies have been approved, but no protective strategy is currently available. Indeed, although the deleterious role of oxidative stress has been clearly established in neuronal but also vascular lesions following cerebral ischemia in preclinical studies, no antioxidant strategy has been shown to be clinically effective as of yet. However, cerium oxide nanoparticles (CNP) present the advantage of having multiple antioxidant capacities (enzymatic and non-enzymatic). In order to improve the stability and biocompatibility of CNP, Specific Polymers® has developed innovative polyethylene glycol (PEG)/ phosphonate copolymers to coat their surface. In addition, these polymers can be functionalized with a peptide that targets the endothelium. This is expected to concentrate the antioxidant effect of CNP in the vessels, in order to reduce the occurrence of cerebral haemorrhages, a serious complication in patients with ischemic stroke. In this context, the aim of this thesis was to assess the impact of CNP's coating on their therapeutic potential in cerebral ischemia. On the one hand, studies were conducted in vitro to establish the toxicity, the antioxidant effect and the cellular internalisation of CNP. On the other hand, CNP's biodistribution and toxicity were assessed in vivo on healthy mice, while their therapeutic potential was evaluated in a mouse model of cerebral ischemia. In vitro studies were performed on murine cerebral endothelial cells (b.End3 cell line). We showed that CNP do not induce mortality or disruption of metabolic activity up to 100µg/mL. At higher concentrations, all CNP induce a disruption of metabolic activity; bare CNP also cause mortality, unlike PEGylated CNP. Glutamate was then used on b.End3 cells to mimic the excitotoxicity that occurs during cerebral ischemia, as it contributes to oxidative stress. Under these conditions, the increase in the production of reactive oxygen species by b.End3 cells, as well as the oxidation of nucleic acids, were counteracted by CNP, demonstrating that their coating does not interfere with their antioxidant properties. Functionalization of CNP with a fluorophore (Cyanine 5) allowed monitoring their internalisation by cytometry and confocal microscopy. We highlighted that CNP are rapidly internalized in b.End3 cells. Electron microscopy studies showed that CNP are mainly localized in endosomes, at the perinuclear level. Finally, we were able to graft a peptide targeting a vascular adhesion protein overexpressed during cerebral ischemia. Further studies will be needed to evaluate the accumulation of grafted CNP at the target site, i.e. activated endothelial cells. In vivo studies established the biodistribution of CNP in Swiss mice: CNP are found during the first hours after injection into mice, before renal elimination. Histopathology revealed no toxicity of the CNP on the liver, kidneys, spleen, lungs and brain of these mice, and no change in their blood counts was observed. CNP were also administered in a murine model of cerebral ischemia, but did not reduce the volume of the lesion under our conditions. In conclusion, the coating of CNP by innovative polymers reduces their toxicity without altering their antioxidant capacities, or their internalization in cerebral endothelial cells. The absence of long-term accumulation and toxicity in vivo is promising for their biocompatibility. Although non-specific CNP did not show a protective effect in vivo, those capable of targeting the endothelium could reduce vascular lesions and the risk of haemorrhage due to cerebral ischemia.