Cibles de substitution essentielles de E. coli comme outil de découverte d'antibiotiques et de mutations de résistance

Target essential surrogate E. coli (TESEC) : a technology platform for tuberculosis drug discovery and the investigation into the mutational landscape of drug targets

• Auteur / Autrice : Nadine Bongaerts
• Direction : Ariel Lindner
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences du vivant appliquées, biotechnologie et ingénierie des biosystèmes moléculaires
• Date : Soutenance le 06/12/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Frontières de l'innovation en recherche et éducation (Paris ; 2006-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Cochin (Paris ; 2002-....)
• Jury : Président / Présidente : Stéphane Lemaire
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Stéphane Lemaire, Barbara Di Ventura, Anshu Bhardwaj, Gregory Bokinsky, Mattew Todd
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Stéphane Lemaire, Barbara Di Ventura

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biologie de synthèse

Mycobacterium tuberculosis

Escherichia coli

Mots clés libres

Biologie synthétique

Mycobacterium tuberculosis

Escherichia coli

Antibiotiques

Synthetic biology

Mycobacterium tuberculosis

Escherichia coli

Drug discovery

Antibiotics

Résumé

La tuberculose (TB) causée par l'agent pathogène bactérien Mycobacterium tuberculosis (Mtb) reste la maladie infectieuse la plus meurtrière au monde. Il y a donc un besoin urgent de nouveaux antibiotiques dotés d'une efficacité améliorée et de nouveaux mécanismes d'action. Le but de ce projet de thèse était de mettre au point une méthode pour tester l'efficacité de librairies d'antibiotiques grâce à des bactéries E. coli modifiées génétiquement dont la croissance dépend de l'expression de l'action de ces antibiotiques sur des gènes cibles de Mtb. Cette approche pourrait compléter les méthodes existantes et pourrait également être utilisée comme plateforme communautaire pour la découverte d'antibiotiques. La construction d'une souche d'E. coli pour le criblage de médicaments nécessite la suppression d'un gène essentiel natif, suivie de la complémentation avec un gène équivalent de Mtb fonctionnel. L'expression de ce gène cible Mtb peut être induite par l'arabinose afin de générer une réponse d'expression log-linéaire. Nous avons montré que le contrôle précis de l'enzyme cible de Mtb permettait d'accroître la sensibilité du médicament aux inhibiteurs spécifiques de la cible lorsque l'expression était réduite, tandis que la surexpression de la cible a entraîné une augmentation de la résistance au médicament. Dans le cadre de cette thèse, nous avons cherché à valider cette approche en se concentrant sur l'alanine racémase (Alr), une cible classique pour Mtb. Pour ce faire, nous avons exposé notre E. coli exprimant Mtb Alr à une vaste collection de molécules naturelles en faisant varier les niveaux d'expression de Mtb Alr. Nous avons pu ainsi mesurer une différence de sensibilité à certains composés inhibiteurs de la cible en fonction des niveaux d'induction, ce qui nous a permis de découvrir un inhibiteur que les autres approches conventionnelles avaient jusqu'ici manqué : le « bénazépril », un médicament normalement utilisé contre l'hypertension. Pour confirmer ces résultats, nous avons d'abord démontrer la spécificité du bénazépril vis-à-vis de la Mtb Alr par des tests enzymatiques dans lesquels le médicament inhibait l'activité de l'alanine racémase. Puis, nous avons démontré que cette molécule était bien efficace directement sur des souches sauvages de Mycobacterium (M. smegmatis mc2155 et M. tuberculosis H37Rv), avec des valeurs de CMI comprises entre 2,25 et 4,5mM chez ces espèces. Nous avons tenté par la suite de démontrer le potentiel de cette approche pour aussi étudier et mieux comprendre les bases moléculaires de la résistance aux médicaments, notamment dûes à des mutations de leurs cibles. Pour continuer avec notre cible candidate, l'alanine racémase, des recherches antérieures ont suggérées que les mutations de l'alanine racémase sont souvent à l'origine de la résistance à la D-cyclosérine (DCS). Pour ce projet, nous avons construit plusieurs librairies de mutants Mtb Alr pour explorer de façon exhaustive le paysage des mutations pouvant conférer une résistance à la DCS. Nous avons non seulement validé plusieurs mutations liées à la résistance précédemment prédites par des études d'associations pangénomiques mais aussi prouvé que d'autres mutations précédemment proposées pourraient ne pas être impliquées dans la résistance ou n'affectant pas directement la liaison de la DCS à sa cible. Ensemble, ces résultats valident le potentiel d'une nouvelle plate-forme technologique pouvant qui pourrait permettre de découvrir de nouvelles molécules pour lutter contre la tuberculose ainsi que les potentielles mutations qui pourraient conduire à une résistance potentielle. La plate-forme peut être étendue à des cibles de médicaments provenant de nombreuses autres bactéries pathogènes et pourrait alimenter un pipeline de nouveaux médicaments candidats nécessaires pour lutter contre la montée de la résistance aux antibiotiques.

Tuberculosis (TB) caused by the bacterial pathogen Mycobacterium tuberculosis (Mtb) remains the deadliest infectious disease in the world, killing 1.7 million people in 2017 (WHO, 2018). There is an urgent need for novel TB antibiotics with improved efficacy and/or new mechanisms of action (WHO, 2018). The aim of this PhD thesis project was to provide a safe, inexpensive and rapid alternative drug screening method based on engineered E. coli cells that depend on the expression of Mtb drug targets for growth. This approach would complement existing methods and could also be used as a community toolbox for collaborative antibiotic discovery. The construction of a E. coli drug screening strain involved the deletion of a native essential gene, followed by the complementation with a functional equivalent Mtb gene. The Mtb target was expressed from an arabinose inducible genetic circuit (Daniel, Rubens, Sarpeshkar, & Lu, 2013) to generate a log-linear expression response. Fine-tuned control of the Mtb enzyme allowed for an increased drug sensitivity to target-specific inhibitors when expression was lowered, whereas target overexpression led to increased drug resistance. While several Mtb drug targets were successfully engineered in E. coli, the drug screening efforts as part of this thesis focused primarily on the known TB drug target alanine racemase (Alr). Alanine racemase is inhibited by the second-line TB drug D-cycloserine that was useful as positive control during the development of the drug screening assays. E. coli expressing Mtb alanine racemase was exposed to compounds of the NIH natural product library and the Prestwick chemical library. By comparing cell growth of Mtb Alr-expressing E. coli cells in presence of low and high inducer concentrations, a ~100-fold difference in sensitivity could be achieved for target-specific inhibitors. This allowed for the discovery of inhibitors that conventional approaches could have missed. As a result, the hypertension drug 'benazepril' was identified as hit compound and further explored for its potential antitubercular properties. Growth inhibition experiments on wild type M. smegmatis MC2 155 as well as M. tuberculosis H37Rv confirmed benazepril as an anti-mycobacterial compound with MIC values between 2.25-4.5 mM. Importantly, benazepril's specificity to Mtb alanine racemase was confirmed in enzyme assays where the drug inhibited alanine racemase activity. This thesis also explored the use of synthetic E. coli strains with Mtb target expression to investigate the molecular basis of drug resistance. With cases of extensively drug-resistant TB on the rise, Mtb treatments will increasingly depend on the use of second-line antibiotics. Previous research (Chernyaeva et al., 2014; Coll et al., 2018; Desjardins et al., 2016) suggests that mutations of alanine racemase, frequently underlie D-cycloserine resistance. For this project, a library based on saturation mutagenesis of the Mtb alr gene and a rationally designed Mtb Alr mutant library were constructed to exhaustively explore the target mutational landscape surrounding cycloserine resistance. We validated several resistance-linked mutations in Mtb Alr that previously predicted on the basis of genome wide association studies with clinical Mtb isolates and found evidence that other proposed mutations might not be involved in resistance or do not directly affect cycloserine-target binding. Eventually, knowledge of the resistance landscapes for more drug targets would support the monitoring of drug resistance in patients and the improved design of antibacterial drugs. Together, these results established the foundation for a technology platform that has the potential to discover new TB inhibitors and resistance mutations. The platform can be extended with drug targets from numerous other pathogenic bacteria beyond Mtb and can fuel the pipeline with new drug candidates that are needed to fight the antibiotic crisis.