Rôle du complexe ESCRT-III dans l'export cytosolique des antigènes au cours de la présentation croisée par les cellules dendritiques

Implication of the ESCRT-III complex in antigen export to the cytosol during cross-presentation by dendritic cells

• Auteur / Autrice : Marine Gros
• Direction : Sebastian Amigorena
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 27/11/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Immunité et cancer (Paris ; 2009)
• Jury : Président / Présidente : Matthieu Piel
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Matthieu Piel, Diana Matheoud, Thomas Wollert, Loredana Saveanu, Mathieu Bertrand
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Matthieu Piel, Diana Matheoud

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules dendritiques

Nécroptose

Mots clés libres

Cellules dendritiques

ESCRT

Présentation croisée

Export cytosolique

Nécroptose

Dendritic cells

ESCRT

Cross-presentation

Cytosolic export

Necroptosis

Résumé

Les Cellules Dendritiques (DC) constituent une population de cellules présentatrices d'antigène professionnelles capables d'activer les Lymphocytes T et d'initier une réponse immunitaire adaptative. En plus de leur capacité à présenter des antigènes exogènes et endogènes (du soi ou viraux) respectivement via les Complexes Majeurs d'Histocompatibilité (CMH) de classe II et de classe I, elles peuvent également capturer, apprêter et présenter des antigènes extracellulaires par le CMH-I. Ce processus, appelé Présentation Croisée («cross-presentation» ou PC), peut être réalisé selon deux voies, la voie vacuolaire et la voie cytosolique, majoritaire. Dans cette dernière, les antigènes sont phagocytés/endocytés avant d'être exportés depuis les phago/endosomes vers le cytosol où ils sont dégradés par le protéasome. Les peptides ainsi générés sont ensuite transférés par les transporteurs TAP dans le réticulum endoplasmique ou dans des compartiments intracellulaires, lieux de leur association aux molécules de CMH-I. Cependant, les mécanismes par lesquels les antigènes sont transférés depuis les endosomes/phagosomes vers le cytosol demeurent mal caractérisés. Deux hypothèses sont proposées pour tenter d'expliquer le déroulement de cette étape clé. La première suppose l'implication d'un transporteur tandis que la seconde avance que l'export des antigènes vers le cytosol résulterait d'une perturbation temporaire de la membrane endo/phagosomale. Longtemps rejeté, le modèle de la «rupture membranaire» nécessiterait la mise en oeuvre de mécanismes de réparation compensatoires pour contenir les dommages endomembranaires et ainsi préserver la viabilité cellulaire. Les travaux réalisés au cours de ma thèse ont porté sur l'étude de l'implication du complexe ESCRT-III (Endosomal Sorting Complex Required for Transport), responsable de la réparation des membranes biologiques, dans l'export cytosolique des antigènes et la PC. Nous avons montré que les DC CD8+, sous-population la plus efficace en termes d'export et de PC, présentent un plus grand nombre de dommages intracellulaires que leurs homologues CD11b+, suite à un traitement par une drogue lysosomotropique. Cette susceptibilité accrue quant à la survenue de dommages endomembranaires dans les DC CD8+ corrèle avec le recrutement de différents composants d'ESCRT-III spécifiquement dans les compartiments intracellulaires de cette sous-population de DC. Par ailleurs, dans une lignée de DC CD8+, l'extinction de l'expression de Chmp4b ou de Chmp2a, deux sous-unités effectrices du complexe, conduit à une augmentation drastique de l'export cytosolique d'un antigène modèle ainsi qu'à une amélioration spécifique de l'efficacité de la PC, in vitro et in vivo. Enfin, au regard de l'implication d'ESCRT-III dans la réparation de dommages membranaires causés par la formation de canaux d'octamères de phospho-MLKL au cours de l'induction de la nécroptose, nous avons étudié les interactions entre cette voie de mort cellulaire et l'export cytosolique des antigènes en supposant qu'en l'absence d'ESCRT-III, ces canaux persistent dans les membranes et sont à l'origine d'une perméabilité accrue, pouvant expliquer le phénotype d'export cytosolique. A la suite de l'inhibition pharmacologique de RIPK3, la kinase phosphorylant MLKL, nous observons une forte diminution de l'export cytosolique dans les DC déficientes pour ESCRT-III. Nos résultats démontrent un rôle majeur de la fonction réparatrice d'ESCRT-III dans la régulation de l'export cytosolique des antigènes et de la PC. Ils renforcent l'idée selon laquelle les antigènes sont exportés dans le cytosol des DC à la suite de perturbations membranaires, plutôt que par l'intermédiaire de transporteurs. La découverte de l'importance fonctionnelle d'ESCRT-III dans une voie immunologique illustre la cooptation de mécanismes eukaryotes ancestraux dans des fonctions propres aux vertebrés supérieurs, telles que l'initiation de réponses immunitaires adaptatives.

Dendritic cells (DCs) play a central role in immune homeostasis by linking innate signals to adaptive responses. In addition to their capacity to expose exogenous antigens on Major Histocompatibility Complex (MHC) class II molecules or endogenous antigens (derived from self or viral proteins) on MHC class I, they also show a remarkable ability to take-up, process and present extracellular antigens on MHC class I molecules. This process, termed Cross-Presentation (CP) plays a critical role in eliciting Cytotoxic T Cell responses to tumors and pathogens that do not readily infect DCs. So far, two main intracellular pathways have been described for CP, namely the vacuolar and the cytosolic pathways, the latter being predominant in CD8+ DC at homeostasis. The first step of the cytosolic pathway resides in the phagocytosis of exogenous antigens that are subsequently exported into the cytosol, where they are processed by the proteasome. The resulting processed antigens can then be channeled through the TAP transporter into the endoplasmic reticulum or into intracellular compartments where they are loaded on MHC class I. While the contributions of the proteasome and TAP transporter to this process are now well established, the way endocytosed antigens gain access to the cytosol remains unclear and is a long-standing matter of controversy, that confronts two main models: transfer through specific transporters or rupture of endocytic membranes and leakage of luminal content. Although the latter hypothesis has been repeatedly dismissed owing to its presumable lack of control, we reasoned that it could only be operational if membrane damages were contained by effective repair, to preserve cell survival. My PhD work thereby focused on the possible implication of the ESCRT-III (Endosomal Sorting Complex Required for Transport) complex, the main repair system for biological membranes, in antigen export to the cytosol during antigen CP by DCs. We showed that CD8+ DCs, corresponding to the most efficient exporting and cross-presenting DC subset, display higher amounts to intracellular damages triggered by a lysosomotropic drug, compared to their CD11b+ counterparts. This increased susceptibility to intracellular damages in CD8+ DCs correlates with the observed enriched recruitment of ESCRT-III subunits in this DC subset's endocytic compartments, relatively to CD11b+ DCs. Additionally, in a CD8+ DC cell line, silencing of Chmp2a or Chmp4b, two effector subunits of ESCRT-III, enhances cytosolic antigen export, as well as in vitro and in vivo CP, without affecting MHC-II presentation. Finally, in the light of recent studies demonstrating that ESCRT-III is repairing steady-state necroptotic damages formed by channels of phospho-MLKL octamers, we studied interactions between the induction of necroptosis and export to the cytosol in ESCRT-III-silenced cells. We supposed that, in absence of a functional repair system, MLKL channels could persist at biological membranes (plasma or endocytic) and result in increased membrane permeability, possibly explaining the increased antigen export phenotype displayed by ESCRT-III-silenced cells. Indeed, following pharmacological inhibition of RIPK3, the kinase phosphorylating MLKL, we observed a strong reduction of antigen export to the cytosol in ESCRT-III-deficient DCs. Altogether, these results show a critical role for membrane repair in containing cytosolic antigen export and CP in DCs. They identify a new fundamental cellular mechanism involved in antigen CP and strengthen the idea that antigens are exiting intracellular compartments following membrane disruption, rather than through transporters. The discovery of the functional relevance of ESCRT-III in a key immunological pathway illustrates the fascinating co-option of ancestral cellular mechanisms present in early eukaryotes in new crucial functions specifically carried by higher vertebrates, such as the induction of adaptive immune responses.