Étude des protéines nucléaires partenaires du GPR88 dans le cortex cérébral et modifications cytoarchitecturales révélées dans le cerveau des souris KO-GPR88

Study of the GPR88 partner nuclear proteins in the cerebral cortex and cytoarchitectural modifications revealed in the brain of KO-GPR88 mice

• Auteur / Autrice : Florian Rebeillard
• Direction : Jorge Diaz, Michèle Darmon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurobiologie
• Date : Soutenance le 27/09/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de psychiatrie et neurosciences de Paris (2008-....)
• Jury : Président / Présidente : Bruno Giros
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bruno Giros, Rolando Meloni, Jérôme Becker, Florence Noble, Séverine Morisset-Lopez, Denis Hervé
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Rolando Meloni, Jérôme Becker

Mots clés

Mots clés contrôlés

Récepteur GPR88

Récepteurs couplés aux protéines G

Mots clés libres

RCPG orphelin

RCPG nucléaire

GPR88

Cortex

Pathologies psychiatriques

Orphan GPCR

Nuclear GPCR

GPR88

Cortex

Psychiatric disorders

Résumé

Les récepteurs couplés à la protéine G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines à la membrane cellulaire impliquée dans la plupart des processus de signalisations physiologiques. Toutefois une centaine de RCPG environ n'a toujours pas de ligand endogène identifié. D'autre part une cinquantaine d'entre eux présentent une localisation intracellulaire atypique soulevant de nombreuses questions quant aux mécanismes d'adressages et de signalisations de ces RCPG intracellulaires. Le GPR88 est un RCPG rapproché de la famille de la rhodopsine qui reste à ce jour sans ligand endogène. Il est abondant dans le striatum avec une localisation préférentielle dans les synapses somatodendritiques des neurones GABAergiques tandis qu'il est faiblement exprimé dans le cortex cérébral. L'invalidation du GPR88, chez la souris par knock-out (KO) du GPR88 et chez des humains par une mutation homozygote invalidante du GPR88, provoque des anomalies de la locomotion et de l'apprentissage chez l'animal et plus spécifiquement un retard mental et du langage chez l'Homme. De plus, un phénotype schizophrène-like a été identifié chez la souris KO et le gène du GPR88 a été associé à la schizophrénie chez l'humain. Nous avons précédemment montré une localisation nucléaire du GPR88 exclusivement dans les neurones du cortex, atypique pour un RCPG, qui est mise en place au cours de la lamination corticale. Comme la protéine entière du GPR88 est adressée au noyau et qu'elle ne possède aucune séquence d'adressage nucléaire identifiée, nous supposons que cet adressage dépend de protéines partenaires. Nos expériences montrent que les domaines de la boucle I3 et C-terminale du GPR88 sont suffisants pour cet adressage. Ainsi un criblage en double hybride avec les domaines I3-Cter fusionnés nous a permis d'identifier des partenaires nucléaires potentiels, incluant ATRX, TOP2B et BAZ2B. Nous avons ensuite pu valider la colocalisation du GPR88 avec ces trois partenaires dans les noyaux de neurones corticaux sur cultures primaire et sur coupes de cerveau WT et KO. Puis nous avons validé ces interactions directes par la méthode « proximity ligation assay » (PLA) sur cultures primaires de neurones corticaux de souris WT et KO et également par la méthode de coimmunoprécipitation sur des extraits de cortex frais de souris adultes WT et KO. Une colocalisation du GPR88 avec des marqueurs d'euchromatine a été montrée, suggérant qu'il pourrait agir en tant que régulateur de l'expression génique. Toutefois, des résultats préliminaires d'expériences d'immunoprécipitation de la chromatine suivi d'un séquençage (ChIP-Seq) sur extrait de cerveaux WT et KO n'ont pas permis d'identifier de domaines d'ADN spécifiquement associés au GPR88. Dans ce contexte, approfondir l'étude du GPR88 pourrait constituer une piste intéressante pour mieux comprendre les aspects atypiques de ces RCPG. Par ailleurs, nous avons identifié une augmentation de la taille des ventricules probablement corrélée à la diminution du nombre d'épines dendritiques observée dans le cortex frontal des souris KO. Par la suite, les hétérotopies identifiées dans la couche corticale I de certaines souris KO suggèrent que l'absence du GPR88 pourrait impacter la migration des neurones corticaux. Nous n'avons toutefois pas pu identifier, à ce jour, d'anomalies dans la mise en place des couches corticales ni dans l'organisation des tonneaux du cortex somatosensorielle. Des expériences biochimiques et histochimiques à la cytochrome oxydase ont montré que l'activité des régions corticales est altérée chez les souris KO comme cela a été rapporté par des expériences d'IRM fonctionnelle. L'ensemble de ces altérations cytoarchitecturales pourrait contribuer au phénotype des souris KO. Finalement, l'identification de nouveaux rôles pour des RCPG pourrait apporter des outils thérapeutiques précieux, avec la promesse de traitements neurologiques et psychiatriques multiples.

G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest family of proteins in the cell membrane involved in most physiological signaling processes. However about one hundred GPCRs still do not have identified endogenous ligand. On the other hand, less than fifty of them present an atypical intracellular localisation raising many questions about the mechanisms of addressing and signaling of these intracellular GPCRs. GPR88 seems to belong to the rhodopsin GPCR family and no endogenous ligand has been identified yet. GPR88 is abundant in the striatum with a preferential localisation in somatodendritic synapses of GABAergic neurons while it is weakly expressed in the cerebral cortex. The loss of GPR88 in knockout mice (KO) of GPR88 and in humans by a homozygous deleterious mutation causes alterations in locomotion and learning in animals and more specifically a mental retardation and speech delay in humans. In addition, a schizophrenic-like phenotype was identified in KO mice and the GPR88 gene was associated with schizophrenia in humans. We have previously shown a nuclear localisation of GPR88 exclusively in the cortex neurons, atypical for GPCR, which is established during cortical lamination. Since the entire GPR88 protein is addressed to the nucleus and does not have any identified nuclear addressing sequence, we assume that proteins partners are need for the addressing. Our experiments show that domains of the I3 and C-terminal loop of GPR88 are sufficient for this nuclear-addressing. Thus, a yeast two hybrid screen with the I3-Cter fused domains allowed us to identify potential nuclear partners, including ATRX, TOP2B and BAZ2B. We were then able to validate the colocalisation of GPR88 with these three partners in cortical neuron nuclei on primary cultures and on WT and KO brain sections. Then we validated these direct interactions by proximity ligation assay (PLA) assay on primary cultures of cortical neurons of WT and KO mice and by coimmunoprecipitation assay on fresh cortex extracts of adult mice WT and KO. Colocalisation of GPR88 with euchromatin markers has been shown, suggesting that it may act as a regulator of gene expression. However, preliminary results from chromatin immunoprecipitation experiments followed by sequencing (ChIP-Seq) on WT and KO brain extract failed to identify DNA domains specifically associated with GPR88. Further studies of the GPR88 could open new way of research to better understand the atypical aspects of these GPCRs. In addition, we have identified enlarged lateral ventricules probably correlated to the decrease of the number of dendritic spines observed in the frontal cortex of KO mice. Subsequently, the heterotopias identified in the cortical layer I of KO mice suggest that the absence of GPR88 could impact the migration of cortical neurons. However, we have not identified any abnormalities in the structure of cortical layers or in the barrel organization of the somatosensory cortex yet. Ours biochemical and histochemical experiments have shown that the activity of cortical regions is impaired in KO mice as reported by functional MRI experiments. All these cytoarchitectural alterations could contribute to the phenotype of KO mice. Finally, the identification of new roles for GPCRs could bring us valuable therapeutic tools, with the promise of multiple neurological and psychiatric treatments.