Étude bioinformatique des protéines PfK13 et PfCRT impliquées dans la résistance de Plasmodium falciparum aux antipaludiques

Bioinformatics analyses of the PfK13 and PfCRT proteins involved in the resistance of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs

• Auteur / Autrice : Romain Coppée
• Direction : Jérôme Clain
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Bioinformatique
• Date : Soutenance le 06/11/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Mère et enfant en milieu tropical : pathogènes, système de santé et transition épidémiologique (Paris ; 2010-...)
• Jury : Président / Présidente : Martin Picard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Martin Picard, Françoise Benoît-Vical, Bernard Offmann, Audrey Sabbagh, Antoine Claessens
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Françoise Benoît-Vical, Bernard Offmann

Mots clés

Mots clés contrôlés

Résistance aux antipaludiques

Phylogénie

Dynamique moléculaire

Sélection naturelle

Bioinformatique

Chloroquine

Artémisinine

Apicomplexes

Plasmodium falciparum

Paludisme

Mots clés libres

Paludisme

Artémisinine

Bioinformatique

Prédiction fonctionnelle

Résistance

Sélection naturelle

Sélection purificatrice

Prédiction structurale

Simulation de dynamique moléculaire

Mutation non-synonyme

Malaria

Artemisinin

Bioinformatics

Functional prediction

Antimalarial resistance

Natural selection

Purifying selection

Structure prediction

Molecular dynamics simulation

Non-synonymous mutation

Résumé

Le paludisme est une maladie infectieuse parasitaire causée par diverses espèces de Plasmodium, P. falciparum étant l'espèce la plus répandue et responsable des cas mortels de la maladie. Les traitements actuels reposent sur des combinaisons thérapeutiques à base d'artémisinine (CTA), couplant un dérivé d'artémisinine (ARTD) à une autre molécule antipaludique. Des parasites résistants aux ARTDs ont émergé en Asie du sud-est ; ceux-ci sont encore non détectés en Afrique. La résistance se traduit par une durée d'élimination des parasites allongée, et est conférée par des mutations non-synonymes localisées sur le domaine Kelch-repeat propeller (KREP) de la protéine P. falciparum K13 (PfK13). Similairement, de multiples mutations non-synonymes sur le transporteur P. falciparum Chloroquine Resistance Transporter (PfCRT) confèrent la résistance à la chloroquine (CQ, ancien traitement) et à la pipéraquine (PPQ, une des molécules partenaires dans les CTAs actuels). Le rôle physiologique de ces protéines, essentielles durant le développement du parasite, demeure mal connu. Ce travail de thèse a donc pour objectif de mieux caractériser PfK13 et PfCRT : i) en prédisant les positions qui seraient impliquées dans des interactions protéine-substrat ; et ii) en étudiant les altérations structurales et physico-chimiques induites par les mutations de résistance. Selon les concepts liés à la théorie de l'évolution moléculaire, les mutations touchant des sites exerçant une fonction critique au sein d'une protéine essentielle sont éliminées par la sélection purificatrice. Ces sites sont donc plus conservés que le reste de la protéine. Par des approches bioinformatiques couplant évolution et structure tertiaire, nous avons mis en évidence des régions extrêmement conservées au sein de PfK13 et PfCRT. En comparant ces résultats avec les données expérimentales de protéines / domaines appartenant aux mêmes familles structurales, nous avons identifié plusieurs sites de PfK13 et PfCRT que nous proposons comme candidats pour des interactions protéine-substrat. À notre surprise, les mutations de résistance aux ARTDs ne sont pas localisées à la surface d'interaction que nous avons prédite sur le domaine KREP de PfK13. Les dynamiques moléculaires que nous avons réalisées sur deux mutations de résistance (C580Y et R539T) ont révélé des déstabilisations structurales locales du domaine KREP. Nous supposons que ces mutations pourraient perturber la stabilité du domaine KREP et ainsi diminuer l'abondance cellulaire de PfK13. Concernant PfCRT, les deux modèles de structure tertiaire, prédits par homologie structurale, montrent que la majorité des mutations de résistance à la CQ et à la PPQ sont localisées au niveau d'une poche probable de liaison que nous avons identifiée au coeur du transporteur. Ces mutations altèrent fortement le potentiel électrostatique à la surface de cette poche, passant d'un potentiel neutre à un potentiel électronégatif. Ce changement de propriété physico-chimique de la poche du transporteur est probablement un déterminant majeur de l'acquisition de la propriété de transport de la CQ di-protonée de la vacuole digestive vers le cytoplasme du parasite. Les sites fonctionnels candidats de PfCRT et PfK13 identifiés doivent maintenant être validés par des approches expérimentales. Nous avons initié des approches biochimiques dites de pull-down différentiels pour le domaine KREP de PfK13. Dans un premier temps, certains domaines PfK13, fusionnés à la glutathion S-transférase (GST), ont été exprimés dans la bactérie Escherichia coli, purifiés, puis incubés avec un lysat parasitaire total afin de caractériser des protéines interagissant avec PfK13. Les mises au point de ces expériences se poursuivent. Dans un second temps, des approches génétiques directement chez le parasite, par des techniques de transfection et d'édition de gènes, seront mises en place pour tester l'importance des sites fonctionnels candidats.

Malaria is an infectious parasitic disease caused by Plasmodium species. P. falciparum is the most prevalent species and is responsible for the majority of the disease burden. Currently, malaria is treated using artemisinin-based combination therapies (ACTs), coupling an artemisinin derivative (ARTD) to another antimalarial drug. After a decade of use, ARTD-resistant parasites have emerged in Southeast Asia; they are currently not found in Africa. Resistance to ARTD is defined as parasites exhibiting in vivo a delayed clearance time following an artemisinin-based treatment, and is conferred by non-synonymous mutations localized in the Kelch-repeat propeller (KREP) domain of the P. falciparum K13 protein (PfK13). Similarly, multiple non-synonymous mutations conferring resistance to chloroquine (CQ) or piperaquine (PPQ, used as partner drug in one ACT) have been reported on the P. falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT). The physiological role of these proteins, essential at least for the intra-erythrocytic development of the parasite, remains poorly understood. This thesis aims to better characterize the PfK13 and PfCRT proteins by: i) predicting the protein regions and positions that would be involved in protein-substrate interactions; and ii) studying structural and/or physicochemical alterations induced by resistance mutations. According to concepts related to the theory of molecular evolution, mutations affecting sites exerting a critical function within an essential protein are eliminated by purifying selection. These sites are therefore more conserved than the rest of the protein. Using bioinformatics approaches combining sets of PfK13 and PfCRT orthologous sequences - respectively at Apicomplexa and Plasmodium scales - and information from protein tertiary structures, we highlighted extremely conserved regions within these two proteins. By comparing these results with those obtained for some proteins / domains belonging to the same structural families and validated at the experimental level, we identified several PfK13 and PfCRT amino acid sites that we propose as candidates for protein-substrate interactions. Remarkably, ARTD resistance mutations are not localized at the interaction surface that we predicted in the KREP domain of PfK13. Molecular dynamics simulations carried out on KREP domains carrying resistance mutations (C580Y and R539T) indicated that these mutations are associated with local structural destabilizations of the KREP domain. We assume that these resistance mutations may disrupt the stability of the KREP domain and, by extension, the whole PfK13 protein whose cellular abundance would be decreased. Regarding PfCRT, using the two tertiary structure models we predicted by structural homology, the majority of CQ and PPQ resistance mutations were found located in a binding pocket at the core of the transporter. Furthermore, these mutations strongly altered the electrostatic potential at the surface of this pocket, from a neutral to an electronegative potential. This change in physicochemical property of the pocket is probably a major determinant in the acquisition of the transport property of di-protonated CQ from the digestive vacuole to the cytoplasm of the parasite. Candidate functional sites of PfCRT and PfK13 identified in our work should be validated by experimental approaches. Here, we initiated differential pull-down biochemical experiments for the KREP domain of PfK13. First, the wild-type PfK13 domains, fused to glutathione S-transferase (GST), were expressed in Escherichia coli, purified, and then incubated with parasite lysate to characterize PfK13-interacting proteins. These experiments are still in progress. In a second step, the importance of candidate functional sites will be tested through genetic approaches directly in P. falciparum parasites using transfection and gene editing techniques.