Apport de l'analyse métabolomique pour la caractérisation des déficits immunitaires chez l'homme

Interest of large-scale metabolomic analysis for the characterization of immune deficits in humans

• Auteur / Autrice : Anne-Claire Boschat
• Direction : Robert Barouki
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire
• Date : Soutenance le 04/11/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Toxicité environnementale, cibles thérapeutiques, signalisation cellulaire (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Dany Anglicheau
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Dany Anglicheau, Christophe Junot, Germain Trugnan, Antonin Lamazière, Sylvain Latour
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christophe Junot, Germain Trugnan

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chromatographie en phase liquide

Syndromes de déficit immunitaire

Spectrométrie de masse

Métabolomique

Mots clés libres

Métabolomique

Spectrométrie de masse

Déficits immunitaires

Metabolomics

Mass spectrometry

Immune deficiencies

Résumé

La métabolomique est la discipline qui vise à analyser l'ensemble des petites molécules d'un liquide biologique ou d'un tissu. Elle utilise des outils aujourd'hui à fort potentiel et suscite un vif intérêt dans la communauté scientifique et particulièrement médicale. Le profilage à large spectre de ces petites molécules ou métabolites dans les liquides biologiques et les tissus chez l'humain est un enjeu majeur en analyse métabolomique, mais des analyses plus ciblées sont aussi pertinentes. De par la grande diversité physico-chimique des petites molécules, il est nécessaire d'utiliser des méthodes complémentaires afin d'assurer une couverture optimale. Cela implique généralement l'utilisation combinée de techniques de chromatographies liquides différentes couplées à de la spectrométrie de masse. La polyvalence des couplages LC-HRMS permet dans la grande majorité des cas de surmonter ce problème et il est complété par des outils bio-informatiques dédiés assurant différentes fonctions, à savoir la détection et l'alignement des variables, les analyses statistiques, la fusion de données et l'identification des métabolites. Dans ce contexte, notre travail vise à développer des approches de LC-MS pour l'analyse métabolomique d'échantillons humain pour l'étude de différents déficits immunitaires. La déficience en CTPS1 a été associée à une capacité altérée de prolifération des lymphocytes activés conduisant donc à une maladie d'immunodéficience combinée. Dans un premier temps, nous avons développé une méthode ciblée de mesure de l'activité de CTPS, par LC-MS, dans les lymphocytes humains et ce afin de pouvoir documenter son rôle dans l'immuno-modulation. Cette technique a été développée, validée et utilisée sur des échantillons humains lymphocytaires, afin de mettre en évidence ce déficit enzymatique en CTPS1 chez des patients porteurs de mutations nouvellement identifiées. CTPS1 étant une enzyme clé dans la synthèse des pyrimidines, nous avons poursuivi la caractérisation métabolique de ce déficit en développant une analyse métabolomique non ciblée par spectrométrie de masse (dite aussi à large spectre). Nous avons utilisé 2 méthodes LC-HRMS dans l'annotation du métabolome de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) humains. Le développement de cette méthode a été réalisé sur des PBMC issus de donneurs sains, mis en culture, stimulés de manière artificielle et traités par un inhibiteur spécifique de la CTPS, la 3 Déazauridine (3DAU). Des milliers de signaux ont été détectés à partir des extraits cellulaires, toutefois l'identification d'une grande partie de ces signaux demeurait inconnue. Dans ce contexte, une base de données a été élaborée à l'aide de composés chimiques de références. La combinaison de méthodes chromatographiques différentes (RP et HILIC) a permis l'identification de près de 400 métabolites dans les PBMC étudiés. Outre les voies métaboliques perturbées lors de la stimulation par le couplage PMA-Ionomycine, nos analyses préliminaires ont montré, comme attendu, l'impact délétère de l'inhibiteur 3DAU sur le métabolisme des pyrimidines, accompagné d'une augmentation de marqueurs de l'apoptose tels que les acides oléique et linoléique. Par la suite, nous sommes passés à l'analyse d'échantillons érythrocytaires de patients, collectés au sein du laboratoire pour le diagnostic d'autres déficits immunitaires combinés sévères (DICS) comme les déficiences en Adénosine Désaminase et Purine nucléoside phosphorylase. Ces études sont parmi les premières à combiner des analyses LC/ESI-HRMS métabolomiques sur des échantillons érythrocytaires rares issus de patients atteints de DICS. Elles constituent la première étape de construction d'une base de données relationnelle incluant données spectrales et biologiques (variations des conditions physiologiques et physio-pathologiques observées) qui pourrait être utilisée pour la caractérisation de biomarqueurs dans le cas d'études cliniques et diagnostiques.

Metabolomics is the discipline that aims to analyze all small molecules of a biological fluid or tissue. It uses tools with high potential today and arouses a keen interest in the scientific and especially medical community. The large-scale profiling of these small molecules or metabolites in body fluids and tissues in humans is a major goal in metabolomic analysis, but more targeted analyzes are also relevant. Due to the large physico-chemical diversity of small molecules, it is necessary to use complementary methods to ensure optimal coverage. This usually involves the combined use of different liquid chromatography techniques coupled with mass spectrometry (LC-MS or LC-HRMS for high resolution devices). The versatility of LC-HRMS couplings in the vast majority of cases overcomes this problem and is complemented by dedicated bioinformatics tools providing different functions, namely the detection and alignment of variables, statistical analysis, fusion data and the identification of metabolites. In this context, our work aims to develop LC-MS approaches for the metabolomic analysis of human samples for the study of different immune deficits. The deficiency of CTPS1 has been associated with an impaired capacity for proliferation of activated lymphocytes thus leading to a combined immunodeficiency disease. Firstly, we developed a targeted method for measuring CTPS activity, by LC-MS, in human lymphocytes in order to document its role in immunomodulation. This technique has been developed, validated and used on human lymphocyte samples, in order to highlight this enzymatic deficiency in CTPS1 in patients with newly identified mutations. Since CTPS1 is a key enzyme in the synthesis of pyrimidines, we continued the metabolic characterization of this deficiency by developing a non-targeted metabolomic analysis by mass spectrometry (also called large scale). We used 2 LC-HRMS methods in the annotation of the metabolome of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of this method was performed on PBMCs from healthy donors, cultured, artificially stimulated and treated with a specific CTPS inhibitor, the 3DAU. Thousands of signals were detected from cell extracts, however identification of many of these signals remained unknown. In this context, a database has been developed using reference chemical compounds. The combination of different chromatographic methods (RP and HILIC) allowed the identification of nearly 400 metabolites in the PBMCs studied. In addition to the disturbed metabolic pathways during stimulation by PMA-Ionomycin coupling (glycolysis, beta-oxidation), our preliminary analyzes showed, as expected, the deleterious impact of the 3DAU inhibitor on the pyrimidine metabolism, accompanied by an increase in markers of apoptosis such as oleic and linoleic acids. Subsequently, we proceeded to the analysis of erythrocyte samples of patients, collected in the laboratory for the diagnosis of other severe combined immunodeficiencies (SCID) such as Adenosine Deaminase (ADA) and Purine nucleoside phosphorylase (PNP). These studies are among the first to combine metabolomic LC / ESI-HRMS analyzes on rare erythrocyte samples from SCID patients. They constitute the first step in the construction of a relational database including spectral data (MS spectra, MS / MS spectra) and biological data (variations of physiological and physio-pathological conditions observed) that could be used for the characterization of biomarkers in the field case of clinical and diagnostic studies.