Identification et caractérisation des sites allostériques d'une UMP kinase bactérienne

Identification and characterization of allosteric sites of UMP kinase

• Auteur / Autrice : Patrick Walter
• Direction : Hélène Munier-Lehmann
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale
• Date : Soutenance le 25/10/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité Chimie et biocatalyse
• Partenaire(s) de recherche : Structure de recherche : Institut Pasteur. Département de Biologie structurale et chimie (2006-….)
• Jury : Président / Présidente : Claudine Mayer
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Adrián Velázquez Campoy
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : U. Helena Danielson, Béatrice Golinelli-Pimpaneau

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cryomicroscopie

Mycobacterium tuberculosis

Radiocristallographie

Tuberculose

Mots clés libres

Tuberculose

Sites allostériques

Cristallographie des rayons X

UMP kinase

Mycobacterium tuberculosis

Cryo-microscopie électronique

Drug discovery

Criblage de fragments

Inhibiteurs

Tuberculosis

Allosteric sites

X-ray crystallography

Cryo-EM

Mycobacterium tuberculosis

UMP kinase

Drug discovery

Fragment screening

Inhibitors

Résumé

Les uridine monophosphate (UMP) kinases bactériennes catalysent le transfert réversible du phosphate gamma de l'ATP vers l'UMP. Essentielles dans la division cellulaire et sans équivalent chez les eucaryotes, elles présentent un intérêt particulier en tant que cible thérapeutique. Au cours de mon projet de thèse, je me suis consacré à l'étude de l'UMP kinase de Mycobacterium tuberculosis, bactérie responsable de la tuberculose. Cette enzyme constitue un prototype des UMP kinases de bactéries à Gram-positif. Mon objectif a été de caractériser les sites allostériques de cette enzyme par des approches biophysiques et structurales. Une étude détaillée de l'interaction des substrats (UMP et MgATP) et effecteurs naturels (UTP et GTP) de l'UMP kinase de M. tuberculosis a été réalisée par différentes approches biophysiques (SPR, ITC, TSA). Il a ainsi été possible de déterminer les KD et le nombre de sites par monomère pour chaque ligand. Le criblage d'une banque de fragments par TSA a aussi permis d'identifier des touches, dont l'interaction avec l'enzyme a été validée pour certains fragments par RMN. Une grande partie de mes travaux a été consacrée à la détermination de la structure tridimensionnelle du site de liaison de l'effecteur négatif (UTP), qui était inconnu jusqu'alors. La résolution de deux complexes a été effectuée : le premier avec l'UTP par cristallographie aux rayons X et le second (UTP et MgATP) par cryo-microscopie électronique. Ces structures pourront constituer un point de départ pour le développement d'inhibiteurs allostériques en tant que nouveaux agents antibactériens.

Bacterial uridine monophosphate kinases catalyze the reversible transfer of gamma phosphate from ATP to UMP. Essential for cell division and without any counterpart in eukaryotic cells, they are of particular interest as a potential anti-infective target. During my three-year PhD project, I have focused on the uridine monophosphate kinase (UMP kinase) from Mycobacterium tuberculosis, bacterium responsible for tuberculosis. The protein is a representative of UMP kinases from Gram positive bacteria. My goal has been to characterize the allosteric sites of this enzyme via biophysical and structural approaches. Detailed investigations concerning the interaction of the UMP kinase from M. tuberculosis with the substrates (UMP and MgATP) and the natural effectors (UTP and GTP) have been performed by different biophysical approaches, namely SPR, ITC and TSA. Moreover, we were able to determine the respective KD values as well as the number of binding sites per monomer. A screening of a small molecule library has been performed by thermal shift assay. Hits have been further validated by NMR experiments to confirm protein-fragment interaction. Much of my work has been devoted to determining the three-dimensional structure of the negative effector binding site (UTP), which was unknown until then. The structure of two complexes have been solved either by X-ray crystallography (complex with UTP) or by cryo-electron microscopy (complex with UTP plus MgATP). The localization and structural resolution of the negative effector binding site will be a starting point for allosteric inhibitors development as new antibacterial agents.