Evolution dirigée d'enzyme in vitro, auto-sélection par programmation moléculaire

In vitro enzyme directed evolution using DNA artificial networks

• Auteur / Autrice : Rémi Sieskind
• Direction : Yannick Rondelez
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 15/10/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Gulliver (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Valérie Taly
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Valérie Taly, Gabrielle Potocki-Veronese, Jean-Christophe Baret, Clément Nizak, André Estévez Torres
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Gabrielle Potocki-Veronese, Jean-Christophe Baret

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines

Protéines recombinées

Génie génétique

Enzymes

Microfluidique

Mots clés libres

Évolution dirigée

Microfluidique

Expression in vitro

Programmation moléculaire

Amplification isotherme

Directed evolution

Microfluidics

Cell-free expression

Molecular programing

Isothermal amplification

Résumé

L'évolution dirigée d'enzymes est une méthode d'ingénierie protéique, qui, en imitant l'évolution naturelle, permet d'adapter, voire même de changer les propriétés catalytiques de celles-ci. Son principe est simple, il consiste en l'introduction de mutations dans la séquence du gène considéré puis en la sélection des meilleures protéines obtenues. Ses enjeux actuels sont principalement l'adaptation de cette méthode à un nombre croissant de protéines cibles et le débit, c'est-à-dire le nombre de mutants testés en parallèle. La plupart des méthodes préexistantes s'appuient sur des cellules vivantes pour exprimer les protéines mutantes et même parfois pour réaliser leurs tests de sélection, par exemple en liant l'activité voulue à la survie ou à un métabolisme plus efficace de la cellule hôte. D'autres méthodes s'appuient sur des rapporteurs fluorescents pour détecter l'activité enzymatique après production in vivo. Cependant, certaines enzymes peuvent être toxiques pour une cellule vivante et les tris par niveau de fluorescence s'avèrent souvent longs et fastidieux. Par ailleurs, l'utilisation de cellules vivantes nécessite généralement une étape de transformation souvent peu efficace qui limite beaucoup le nombre de mutants testés à chaque cycle. De ce constat est née l'idée de créer une méthode de sélection intégralement in vitro, versatile et permettant de s'affranchir des problèmes de toxicité, d'augmenter significativement le débit de sélection et de réaliser les tests de sélection dans des conditions plus contrôlées et plus proches des conditions d'utilisation finale de l'enzyme considérée. Cependant, si les systèmes d'expression acellulaire ont fait de grands progrès ces dernières années, notamment en matière de rendement, la problématique principale a été de lier un gène d'intérêt avec sa protéine correspondante sur un support matériel afin de pouvoir réaliser des tests individualisés. Pour cela, nous avons choisi de travailler avec des billes d'hydrogel et de créer un appareil microfluidique pour les générer à très haut-débit. Devant l'impossibilité d'exprimer efficacement les protéines à partir d'une unique copie de chaque gène, nous avons couplé la génération de billes avec l'encapsulation et la pré-amplification des mutants à l'intérieur de celles-ci. Sont venues ensuite les étapes d'expression in vitro et de tagging (d'accroche sur la bille), réalisées à l'intérieur de micro-gouttes contenant une bille afin d'assurer que les protéines produites et accrochées correspondent exactement au gène initialement présent dans la bille. A partir de ces billes ainsi préparées, il nous a été possible de mettre au point une méthode d'auto-sélection utilisant un programme moléculaire. Ce programme moléculaire utilise la PEN DNA toolbox, qui, à partir de courts brins d'ADN interagissant avec quelques enzymes (polymérase, exonucléase, nickase), peut convertir une activité enzymatique en une production de courts oligonucléotides tels que des amorces de PCR. Basée sur le même principe que la CSR d'Holliger, notre méthode utilise un tel programme encapsulé dans une goutte avec une bille. Si l'enzyme accrochée sur la bille est « bonne », le programme génère automatiquement des amorces servant à la réalisation d'une PCR du gène correspondant, dans le cas contraire, le programme ne produit rien. Ainsi, les meilleurs mutants se répliquent plus que les moins bons, menant, en définitive, à une banque finale de mutants enrichie dans les meilleurs candidats. En guise de preuve de principe nous nous sommes intéressés à une nickase très utilisée dans nos programmes moléculaires : nb.BsmI. Après avoir prouvé la possibilité de lier sur une bille d'hydrogel un gène et la protéine correspondante ainsi que notre capacité à réaliser le test de sélection, nous avons caractérisé l'efficacité de sélection sur une librairie simple ne contenant qu'un mutant actif et un mutant inactif.

Enzyme directed evolution is a protein engineering strategy mimicking the natural selection process used to adapt or change catalytic properties of enzymes of interest. It consists on the two following successive steps: the artificial introduction of mutations in a gene of interest and and a user-oriented selection of the best mutants. Some of the current challenges in this field are the throughput (i.e. the number of mutants tested at each cycle) or the expanding of the method to more and more new targets. Most of the available approaches for now rely on living cells to produce mutant proteins. Some of them even use these cells to perform their selection tests, through e.g. the survival of the host or an impact on their metabolism. Other resort to the conversion of the catalytic activity into fluorescent reporters. However, some enzymes can be toxic and thus cannot be expressed in vivo, and the screening in the case of fluorescent signal can often be tedious. Moreover, living cells need, most of the time, to be transfected, a very limiting step in term of throughput. Expanding the field of directed evolution thus requires new methods to target more functions. That is why, we decided to try to tackle some of these problems by developing a versatile, fully in vitro selection method, involving cell-free protein expression, DNA-encoded molecular programs and the use of hydrogel beads. Such a method might allow to get rid of toxicity issues, to increase significantly the selection throughput and to test enzymes in a more close-to-application fashion. Drawing inspiration from Holliger's Compartmentalized Self Replication (CSR), we use PEN DNA molecular programs to link an enzyme activity to the replication of its own gene, allowing a ''hands-off'' self-selection of improved enzymes. Indeed, the PEN DNA toolbox principle is based on small DNA oligonucleotides interacting with each other and with a few enzymes (Polymerase, Exonuclease and Nickase). Programs can present various interesting behaviors, like, among other, the ability to convert a catalytic activity into the generation of PCR primers that can be used for a subsequent PCR. But to screen the incredibly large number of possible mutations, we have to create very large mutants libraries and we need to individualize the selection tests. To do so, we link each mutant's gene with its corresponding protein on hydrogel beads produced at very high throughput using microfluidics. We then compartmentalize the reaction in micro-droplets to assess hundreds of millions of different enzymes at the same time. In each of these compartments, the selection test is performed. Good catalysts trigger the production of primers by the molecular program and thus the replication of their own gene while the worst of them do not at all. Gathering all the replicated genes at the end of the process, we obtain a new gene library enriched in the best mutants. As a first proof of principle, we use the nb.BsmI nicking enzyme that is a key part of the PEN DNA toolbox. In this thesis, we prove our ability to amplify clonally a gene inside a hydrogel bead, to express in vitro the corresponding proteins, to attach these proteins on the hydrogel bead and to perform the selection test. We also assess the selection efficiency of the method, looking at how it works on a very simple library, composed of an active and an inactive mutant.