Quantification de la translocation membranaire et de l'échappement endosomal : une approche de biologie chimique

Quantification of membrane translocation and endosomal escape : a chemical biology approach

• Auteur / Autrice : Marco Lucchino
• Direction : Frédéric Schmidt, Ludger Johannes
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie biologique
• Date : Soutenance le 02/10/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité Chimie et biologie de la cellule (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Laurent Micouin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Laurent Micouin, Sandrine Sagan, Tanja Weil, Frédéric Taran, Jost Enninga
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Sandrine Sagan, Tanja Weil

Mots clés

Mots clés contrôlés

Shiga-toxines

Endosomes

Macromolécules

Médicaments -- Mise au point

Administration (pharmacologie)

Translocation (génétique)

Mots clés libres

Échappement endosomique

Translocation

Administration de médicaments

Développement de médicaments

Quantification

Endosomal escape

Translocation

Drug delivery

Drug development

Quantification

Résumé

Malgré les grands progrès dans la mise au point d'outils thérapeutiques, il reste encore beaucoup de difficultés à surmonter pour mettre au point des modalités de traitement contre le cancer, les plus efficaces possibles. Au cours de ces dernières années, le processus cellulaire d'échappement endosomal, ou plus généralement de translocation membranaire, est devenu un sujet d'intérêt, et sa faible efficacité apparaît aujourd'hui comme le principal obstacle au développement de nouvelles médicaments macromoléculaires, telles que les conjugués protéiques, les nanoparticules oligonucléotides thérapeutiques etc. En effet, en se liant à la surface cellulaire, la plupart des transporteurs thérapeutiques intériorisés ne traversent pas spontanément les membranes cellulaires, restant piégés dans la voie endocytaire. Jusqu'à présent, malgré un effort remarquable, peu de technologies et de stratégies ont été décrites pour favoriser efficacement la translocation des endosomes du lumen vers le cytosol. L'une des raisons qui ralenti les progrès d’élaboration de stratégies efficaces pour favoriser l'échappement endosomal, réside dans la difficulté de quantifier avec précision l'étape de translocation au niveau de la membrane et donc de disséquer mécaniquement le processus. Par conséquence, la première partie de mon doctorat était focalisée sur le développement d'un test universel, quantitatif, sensible et robuste, visant l'investigation et la quantification du processus d'échappement endosomal. Dans la deuxième partie, j'ai appliqué le nouvel essai pour étudier et quantifier la translocation membranaire de la sous-unité B de la toxine Shiga (STxB). Objectif 1 : Sur la base d'une analyse précise des tests actuellement disponibles et de la compréhension complète de leurs inconvénients, nous avons développé un système robuste et sensible qui permet de quantifier la translocation cytosolique pour un porteur donné. Notre stratégie repose sur la modification d'un porteur donné qui se produit exclusivement dans le cytosol de la cellule et qui permet de discriminer, d'isoler et puis de quantifier, la fraction du porteur qui a été transloquée dans le cytosol. La modification cytosolique est effectuée par un système de marquage qui s'exprime exclusivement dans le cytosol et comprend la fusion de deux protéines. La première, conventionnellement appelée Tag 1, est responsable de la liaison covalente et irréversible du porteur transloqué. La seconde, Tag 2, est exploitée comme crochet pour isoler la fraction marquée, permettant ainsi sa quantification. Les protéines SNAP-tag, HaloTag et NeonGreen ont été choisies comme Tags potentiels, et leur activité a d'abord été évaluée in vitro, à l'aide de modèles simplifiés, puis corroborée dans un système cellulaire, en s'assurant que chaque étape se déroulait avec une cinétique rapide et une production quantitative. La protéine SNAP-tag a été identifiée comme le meilleur candidat pour le Tag 1, tandis que la protéine NeonGreen représente le Tag 2, c’est à dire le crochet pour isoler la fraction cytosolique. Le système de marquage cytosolique SNAP-NeonGreen a permis le développement d'un test très sensible, capable de détecter des quantités infimes de protéines transloquées, jusqu'à la plage picomolaire. La protéine de fusion SNAP-NeonGreen a été mise en œuvre dans une lignée cellulaire cancéreuse monoclonale stable pour l'évaluation et la quantification de l'efficacité de translocation du STxB. Objectif 2 : La première application du nouvel essai a été d'étudier la capacité de translocation du STxB. Nous montrons d'abord que la translocation du STxB dépend du récepteur, du temps et de la concentration, et qu'elle est supprimée dans des conditions de privation d’ATP, ainsi que d'incubation à basse température. Pour la première fois, nous avons ensuite fourni une quantification absolue de la translocation du STxB à 37°C, sur une période de 4 heures, dans le modèle cellulaire HeLa.

Objectives of the project despite great progress in the development of therapeutic delivery tools, significant difficulties still need to be overcome for the development of maximally efficient cancer treatment modalities. In the past few years, the cellular process of endosomal escape, or more in general membrane translocation, has become a focus of interest, and its low efficiency now appears as the main obstacle for the development of new macromolecular therapeutics, such as protein conjugates, therapeutic oligonucleotide nanoparticles etc. Indeed, upon binding to the cell surface, most of the internalized therapeutic carriers fail to cross cellular membranes spontaneously, remaining trapped within the endocytic pathway. Up to now, despite the remarkable effort, only few technologies and strategies have been described that can efficiently promote the translocation from the lumen of endosomes to the cytosol. One of the reasons for the slow progress in developing efficient strategies to foster endosomal escape resides in the difficulty to accurately quantify the membrane translocation step and therefore to mechanistically dissect the process. Hence, the first part of my PhD was focused on the development of a universal, quantitative, sensitive, and robust assay aimed at the investigation and quantification of the endosomal escape process. In the second part, I have applied the newly developed assay to study and quantify the membrane translocation of the engineered therapeutic carrier Shiga toxin B-subunit (STxB). Objective 1: Engineering a cytosolic tag Based on an accurate analysis of the currently available assays and the full understanding of their drawbacks, we developed a robust and sensitive system that allows the quantification of the cytosolic translocation for a given carrier. To avoid artefacts and limitations of the previously described assays, we excluded subcellular fractionation procedures and the use of fluorescence ligands, FACS and Western blotting as readout methods. Indeed, our strategy relies on modification of a given carrier that exclusively occurs within the cytosol of the cell and that allows to discriminate, isolate, and subsequently quantify the fraction of the carrier that was translocated to the cytosol. The cytosolic modification is carried out by a tag system that is exclusively expressed in the cytosol and comprises the fusion of two proteins. The first, conventionally referred as Tag 1, is responsible to covalently and irreversibly binding the translocated carrier, while the second, Tag 2, is exploited as hook to isolate the tagged fraction, thereby allowing its quantification. SNAP-tag, HaloTag and NeonGreen protein have been chosen as potential Tags, and their activity has been evaluated first in vitro, using simplified models, and then corroborated in a cellular system, making sure that each step occurred with rapid kinetics and quantitative yield. SNAP-tag protein has been identified as the best candidate for Tag 1, whereas NeonGreen protein represents Tag 2, namely the hook to isolate the cytosolic fraction. The cytosolic SNAP-NeonGreen tag system allowed the development of a highly sensitive assay, able to detect minute amounts of translocated protein, down to the picomolar range. The SNAP-NeonGreen fusion protein has been implemented in a monoclonal stable cancer cell line for the evaluation and quantification of STxB translocation efficiency. Objective 2: Evaluation of STxB translocation The first application of the newly developed assay was to investigate the translocation capacity of STxB. We first show that STxB translocation is receptor, time, and concentration dependent, and is abolished in ATP-depletion and low temperature incubation conditions. For the first time, we then provided an absolute quantification of STxB translocation at 37°C, over a period of 4 hours, in HeLa cell.