Rôle de CD63 dans la biogenèse et la fonction des exosomes

Role of CD63 in the biogenesis and the function of exosomes

• Auteur / Autrice : Roberta Palmulli
• Direction : Guillaume Van Niel, Graça Raposo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 22/11/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie cellulaire et cancer (Paris ; 1995-....)
• Jury : Président / Présidente : Pascale Zimmermann
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pascale Zimmermann, Fabien Alpy, James Edgar, Claire Desnos
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Fabien Alpy, James Edgar

Mots clés

Mots clés contrôlés

Origine de la vie

Exosomes

Mots clés libres

Exosomes

CD63

Cholestérol

Mélanome

Exosomes

CD63

Cholesterol

Melanoma

Résumé

Les exosomes sont des vésicules de 30 à 200 nm libérées par tous les types cellulaires qui contiennent des sets spécifiques de protéines, d'ARN et de lipides. La sécrétion et l'échange intercellulaire des exosomes et de leurs contenus sont impliqués dans la plupart des processus tant physiologiques que pathologiques comme la progression de cancers métastatiques tels que le mélanome. Les capacités fonctionnelles des exosomes sont directement liées à leur composition et aux machineries moléculaires qui régulent leur biogenèse. Le but de mon projet de thèse a été d'étudier une des voies de biogenèse des exosomes et d'établir une relation fonctionnelle entre composition et fonction des exosomes en particulier lors du développement du mélanome cutanée. Les exosomes sont générées sous forme de vésicules intraluminales (ILV) dans la lumière des endosomes multivésiculaires (MVE). Dans ces compartiments, les protéines et lipides membranaires sont soit exclus du MVE par bourgeonnement externe soit séquestrés sur les ILV par bourgeonnement interne. Parmi les différents mécanismes de tri qui régulent la biogenèse de l'ILV je me suis intéressée à celui impliquant la tétraspanine CD63. Les tétraspanines sont une famille de protéines à quatre domaines transmembranaires qui régulent le trafic, le clivage et la signalisation de protéines en les incorporant dans des microdomaines enrichis en certains lipides comme le cholestérol. CD63 est la seule tétraspanine principalement localisée sur les ILVs des MVEs et elle est largement utilisée comme marqueur d'exosomes. Néanmoins, son rôle dans la biogenèse des exosomes n'est toujours pas bien compris et a été l'objet principal de mes recherches. J'ai pu montrer que dans la lignée cellulaire HeLa, CD63 régule le tri du cholestérol sur les ILV et les exosomes. En l'absence de CD63, le cholestérol est exclu des MVEs par un mécanisme actine-dépendant de bourgeonnement externe pour être adressé à d'autres compartiments cellulaires. Dans la lignée cellulaire de mélanome pigmentée MNT-1, j'ai confirmé ce mécanisme et montré sa relevance physiologique dans le tri de l'apolipoprotéine E endogène (ApoE) aux ILVs, un processus nécessaire aux premières étapes de la pigmentation. De façon intéressante, l'expression d'ApoE et de CD63 est associée à une inhibition des capacités métastatiques des mélanomes. En parallèle, j'ai étudié la relevance de ce processus de tri sur les propriétés pro-métastatiques des exosomes de mélanomes en me focalisant sur leur potentielle interaction avec la matrice extracellulaire. Mes travaux montrent que les cellules de mélanome sécrètent des sous-populations d'exosomes à la composition distincte. L'enrichissement en ApoE d'une de ces sous-populations est directement corrélé à leur incapacité à interagir avec le collagène. Enfin, nous avons testé l'hypothèse selon laquelle l'interaction exosomes-collagène pouvait influencer les capacités migratoires des cellules de mélanome. Globalement, mes données établissent CD63 comme régulateur de la balance entre les processus d'import et d'export dans les MVEs qui contribuent à l'homéostasie endosomale. En particulier, mes recherches montrent que CD63 module la composition des exosomes en régulant le tri du cholestérol (et de l'ApoE) dans les ILV et les exosomes et lient ce mécanisme de tri à la capacité des exosomes à interagir avec l'environnement extracellulaire.

Exosomes are 30 to 200 nm vesicles released by all cell types that contain specific sets of proteins, RNAs and lipids. The secretion and intercellular exchange of exosomes and their contents are involved in most physiological and pathological processes, such as the progression of metastatic cancers including melanoma. The functional capacities of exosomes are directly related to their composition and to the molecular machineries that regulate their biogenesis. The aim of my thesis project was to study one of the biogenesis pathways of exosomes and to establish a functional relation between composition and function of exosomes, especially during the development of cutaneous melanoma. Exosomes are generated as intraluminal vesicles (ILVs) in the lumen of multivesicular endosomes (MVEs). In these compartments, membrane proteins and lipids are either excluded from MVEs by external budding or are sequestered on ILVs by internal budding. Among the different sorting mechanisms that regulate the biogenesis of ILV I was interested in the one involving the tetraspanin CD63. Tetrapanins are a family of four transmembrane domain proteins that regulate the trafficking, cleavage and signaling of proteins by incorporating them into microdomains enriched in certain lipids such as cholesterol. CD63 is the only tetraspanin mainly located on ILVs of MVEs and is widely used as a marker for exosomes. Nevertheless, its role in the biogenesis of exosomes is still not well understood and has been the main focus of my research. I was able to show that in the HeLa cell line, CD63 regulates the sorting of cholesterol on ILVs and exosomes. In the absence of CD63, cholesterol is excluded from MVEs by an actin-dependent external budding mechanism to be addressed to other cellular compartments. In the pigmented melanoma cell line MNT-1, I confirmed this mechanism and showed its physiological relevance in the sorting of endogenous apolipoprotein E (ApoE) to ILVs, a necessary process in the early stages of pigmentation. Interestingly, the expression of ApoE and CD63 is associated with an inhibition of the metastatic capacities of melanomas. In parallel, I studied the relevance of this sorting process on the pro-metastatic properties of melanoma exosomes by focusing on their potential interaction with the extracellular matrix. My work shows that melanoma cells secrete subpopulations of exosomes with distinct composition. ApoE enrichment of one of these subpopulations is directly correlated with their inability to interact with collagen. Finally, we tested the hypothesis that the exosome-collagen interaction could influence the migration capacity of melanoma cells. Overall, my data establish CD63 as a regulator of the balance between import and export processes in MVEs that contribute to endosomal homeostasis. In particular, my research shows that CD63 determines the composition of exosomes by regulating cholesterol (and ApoE) sorting in ILVs and exosomes and links this sorting mechanism to the ability of exosomes to interact with the extracellular environment.