Étude fonctionnelle du récepteur couplé aux protéines G orphelin GPR88 et modulation de son activité pharmacologique à l’aide de fragments d’anticorps VHH (nanobodies)

Functional characterization of the orphan G protein-coupled receptor GPR88 and modulation of its pharmacological activity using antibody fragments VHH (nanobodies)

• Auteur / Autrice : Thibaut Laboute
• Direction : Jérôme Becker
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 17/12/2019
• Etablissement(s) : Tours
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Physiologie de la Reproduction et des Comportements (Tours)
• Jury : Président / Présidente : Catherine Belzung
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Julie Le Merrer, Brigitte L. Kieffer, Jorge Diaz
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Julie Kniazeff, Marc Parmentier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transfection

Tests de toxicité in vivo

Tests de toxicité in vitro

Complexes récepteur-ligand

Récepteur GPR88

Anticorps à domaine unique

Criblage pharmacologique

Expression génique

Récepteurs

Opioïdes

Protéines de la matrice extracellulaire

Espace extracellulaire du cerveau

Récepteurs couplés aux protéines G

Mots clés libres

RCPG

Anticorps

Pharmacologie

Antibody

Pharmacology

VHH

GPCR

Résumé

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont des récepteurs à 7 domaines transmembranaires. Ces RCPG ont pour fonction principale d’intégrer un signal extracellulaire en une cascade d’évènements intracellulaires. Les RCPG sont impliqués dans le contrôle de nombreux processi biologiques et sont la cible d’environ 30% des traitements pharmacologiques actuels. La famille des RCPG est constituée de plus de 1000 membres, parmi lesquels les récepteurs dits « orphelins » (environs 140) pour lesquels aucun ligand endogène n’a encore été identifié.Le récepteur GPR88 est un récepteur orphelin exprimé dans le SNC, et plus particulièrement dans les régions striatales. Son implication a été proposée dans de nombreuses pathologies neuropsychiatriques telles que l’addiction, la schizophrénie ou la Chorée de Huntington. Mais, sa pharmacologie reste peu connue et les outils pharmacologiques disponibles pour étudier sa fonction sont très limités. Dans ce contexte, les objectifs de ma thèse ont été : 1) d’étudier la pharmacologie du récepteur GPR88, et sa capacité à moduler l’activité d’autres RCPG, et 2) d’identifier et de caractériser des outils pharmacologiques innovants, sous la forme de fragments d’anticorps, ciblant le récepteur GPR88 et modulant son activité.Le point de départ du 1er volet de ma de thèse a été le constat d’une augmentation de la signalisation du récepteur aux opioïdes delta (DOR) sur la voie des protéines G chez les souris Gpr88 KO, qui nous a conduit à émettre l’hypothèse d’une interaction physique et fonctionnelle entre GPR88 et DOR, mais aussi, potentiellement, entre GPR88 et d’autres RCPG. Nous avons ainsi révélé que GPR88 forme des hétérodimères avec les trois récepteurs aux opioïdes (DOR, le récepteur mu aux opioïdes MOR et le récepteur kappa aux opioïdes KOR), et inhibe leur signalisation (G et b-arrestine (b-arr) dépendantes). Chez les souris Gpr88-/-, la perte de l’influence de GPR88 sur la signalisation de MOR se traduit par une augmentation drastique de la sensibilisation comportementale à la morphine. Nous avons ensuite étendu l’évaluation de l’effet de la co-expression de GPR88 à d’autres RCPG exprimés ou non dans le striatum. Nous avons alors découvert que GPR88 diminue l’activation de la voie G de la plupart des récepteurs dont il est proche physiquement, mais qu’il entrave le recrutement des b-arr à tous les récepteurs testés. Ce travail montre pour la première fois que GPR88 est capable de biaiser la signalisation d’autres en bloquant le recrutement des b-arr même en l’absence de formation d’hétérodimères avec le RCPG cible.Il n’existe à l’heure actuelle que 3 ligands ciblant le récepteur GPR88, 3 agonistes de faible efficacité. Dans le 2e volet de mes travaux de thèse, j’ai mis en œuvre une nouvelle stratégie pour identifier des molécules capables de reconnaitre GPR88 et d’en moduler l’activité : l’identification et la caractérisation de fragments d’anticorps simple chaine, ou nanobodies (VHH), capables de lier le récepteur. Ils partagent les caractéristiques d’affinité et de spécificité des Ig entières, mais sont moins immunogènes, plus simples à générer et à produire en système procaryote, et peuvent être administrés par diverses voies. Un lama a tout d’abord été immunisé avec des membranes de cellules exprimant GPR88 puis une banque de phages a été constituée à partir des ARNm codant pour les Ig simple chaine de l’animal. Le criblage de cette banque m’a permis d’identifier 2 nanobodies capables de lier GPR88, avec une forte affinité. Ils VHH se comportent comme un ligand de GPR88 avec un profil pharmacologique très atypique. Nous avons montré in vitro qu’il se comporte comme un agoniste inverse de GPR88 lorsqu’il est administré seul ; mais en présence d’un agoniste il se comporte comme un modulateur allostérique positif. De manière remarquable, nous avons retrouvé ce même profil après administration intra-cérébroventriculaire du VHH in vivo chez la souris.

G-protein coupled receptors (GPCRs) are seven transmembrane domain receptors whose sequence is highly conserved in evolution. Their main function is to integrate an extracellular signal into a cascade of intracellular events. GPCRs are involved in the control of many biological processes and are the target of about 30% of current pharmacological treatments. The GPCR family consists of more than 1000 members, including the so-called "orphan receptors” (about 140) for which no endogenous ligand has been identified yet.GPR88 is an orphan receptor expressed in the central nervous system, especially in striatal regions. Its involvement has been proposed in many neuropsychiatric pathologies such as addiction, schizophrenia or Huntington's Chorea. Unfortunately, only a handful of synthetic ligands are available that target GPR88 and its pharmacology remains poorly understood. In this context, the objectives of my thesis were: 1) to study the pharmacology of the GPR88 receptor, with a focus on its ability to modulate the activity of other GPCRs, and 2) to identify and characterize innovative pharmacological tools, namely antibody fragments or nanobodies, that target GPR88 and modulate its activity.The starting point of the first part of my thesis work was the observation of an increase in G-protein pathway signaling of the delta opioid receptor (DOR) in Gpr88 knockout mice, which led us to hypothesize a physical and functional interaction between GPR88 and DOR, but also, potentially, between GPR88 and other GPCRs. Indeed, we have revealed that GPR88 forms heterodimers with the three opioid receptors (DOR, the mu opioid receptor MOR and the kappa opioid receptor KOR), and inhibits their signaling (G-protein and b-arrestin dependent). In Gpr88-/- mice, the loss of GPR88's influence on MOR signaling results notably in a drastic increase in morphine-induced behavioral sensitization. We then extended the evaluation of the effects of GPR88 co-expression to other GPCRs expressed or not in the striatum. We evidenced that GPR88 GPR88 can decrease the G protein-dependent signaling of most receptors in close proximity, but impedes b-arrestin recruitment by all receptors tested. This work shows for the first time that the GPR88 receptor is able to bias the signaling of other GPCRs by hampering the recruitment of b-arrestins independently from its physical proximity to these target receptors and putative heterodimer formation.There are currently only three ligands available to target GPR88, three agonists with low efficacy. In the second part of my thesis work, I implemented a new strategy to identify molecules capable of targeting GPR88 and modulating its activity: the identification and characterization of llama single chain antibody fragments, so called nanobodies, that bind the receptor. They share the affinity and specificity characteristics of whole immunoglobulins, but are less immunogenic, easier to generate and produce in the prokaryotic system, and can be administered by various routes. A llama was first immunized with cell membranes expressing GPR88 and then a phage library was created after extraction of the mRNAs encoding the animal's single-chain immunoglobulins, each of the phages expressing a nanobody at its surface. The screening of this library on cell membranes expressing GPR88 allowed me to identify two nanobodies capable of binding GPR88, one of them with a high affinity. This latter nanobody behaves like a GPR88 ligand with a very atypical pharmacological profile. Indeed, we have shown in vitro that it works as an inverse agonist of the GPR88 receptor when administered alone; in the presence of an agonist, however, it behaves as a positive allosteric modulator, facilitating the effects of the agonist. Remarkably, we have found the same profile after intracerebroventricular administration of the nanobody in vivo in mice.